哮喘气道炎症粘附机制的实验研究

中华结核和呼吸感染 1999年第3期第22卷 论　　著

作者：李寅　叶曜芩

单位：200052 上海，第二军医大学长征医院呼吸科(李寅现在解放军第四五五医院内科)

　　关键词： 哮喘；白细胞介素8；嗜酸粒细胞阳离子蛋白

　　【摘要】　目的　评价细胞间粘附分子1（ICAM-1）、P选择素在哮喘气道炎症粘附机制中的作用，进一步阐明哮喘的发病机理。方法　用酶联免疫吸附试验、肺组织免疫组化检查和呼吸生理学方法系统观察正常组和哮喘组豚鼠各项指标。结果　(1)哮喘组豚鼠肺潮气量、动态肺顺应性(C_dyn)和肺气道阻力与对照组比较差异有显著性（P＜0.01及P＜0.05)。(2)哮喘组豚鼠血浆和肺泡灌洗液（BALF）可溶性ICAM-1(sICAM-1)、可溶性P选择素、血清和BALF嗜酸粒细胞阳离子蛋白(ECP)与对照组比较，差异有显著性(P＜0.01)；BALF中白细胞介素8(IL-8)与对照组比较差异也有显著性(P＜0.01)。(3)哮喘组豚鼠肺组织(气道上皮和血管内皮)ICAM-1和IL-8表达与对照组比较，差异有显著性(P＜0.01)。结论　ICAM-1、P选择素、IL-8、ECP参与介导了哮喘气道炎症的粘附过程。

　　Experimental study on adhesion mechanism of airway inflammation in the pathogenesis of bronchial asthma　　LI Yin, YE Yaoqin. Department of Respiratory Medicine, Shanghai NO.455 Hospital, Shanghai 200052

　　【Abstract】　Objective　To investigate the adhesive mechanism of airway inflammation in the pathogenesis of asthma.Methods　The guniea pigs were divided into 2 groups,the asthmatic animal group and the normal animal group.The following tests were performed: (a) The values of sICAM-1,sP-selectin,IL-8 and ECP both in plasma (or serum) and BALF were measured by ELISA.(b) The expressions of ICAM-1 and IL-8 on the bronchial epithelial cells and vascular endothelial cells were measured by immuno-histochemistry staining.(c) The lung functions(VT,Cdyn,R_L)were tested.Results　(a) The values of sICAM-1,sP-selectin and ECP were elevated both in the plasma and BALF level of asthmatic group (P＜0.01). Additionally,IL-8 of BALF level of asthmatic group was elevated (P＜0.01), while IL-8 of serum level was lower than that of normal group（P＜0.01). (b)The expressions of ICAM-1,IL-8 on the bronchial epithelial and vascular endothelial cells in asthmatic animals were up-regulated (P＜0.01). (c) The lung functions of the asthmatic animals were impaired (V_T，C_dyn P＜0.01；R_L P＜0.05).Conclusions　ALL the results above suggests that ICAM-1,IL-8,P-selectin and ECP are involved in the inflammative adhesive mechanism of asthma.

　　【Key words】　Asthma　　Interleukin-8　　Eosinophilic cationic protein

　　哮喘是一种由多种细胞特别是肥大细胞,嗜酸粒细胞及淋巴细胞参与的慢性气道炎症性疾病。哮喘发病机制复杂，尽管目前已了解细胞间粘附分子1(ICAM-1)介导了气道炎症反应，但由于粘附分子家族种类繁多、功能各异，且在炎症粘附机制中与细胞因子网络相互影响，因此对哮喘气道炎症粘附机制的研究远未能完全澄清，且已成为国内、外对哮喘发病机制的研究热点。我们的研究旨在通过观察ICAM-1、P选择素、白细胞介素8(IL-8)、嗜酸粒细胞阳离子蛋白(ECP)在哮喘炎症粘附机制中的作用，以进一步阐明哮喘发病机制。

　　材料与方法

　　一、哮喘模型

　　实验选用4月龄豚鼠20只，体重约350～550 g。采用常规方法^［1］将豚鼠分为两组，即哮喘组豚鼠10只，腹腔内注射10%鸡卵蛋白1 ml致敏，2～3周后，用1%鸡卵蛋白溶液喷雾诱发哮喘发作；对照组豚鼠10只，分别腹腔注射1 ml和2～3周后雾化吸入0.9%生理盐水。

　　二、标本制备

　　1.血浆：在再次激发24小时后，两组豚鼠心脏穿刺取血，血液置于抗凝管中（内有抑肽酶及二乙胺四乙酸二钠），3 000 r／min，4℃离心5～10分钟，吸取上清，置于-70℃保存。

　　2.血清：心脏穿刺取血后，血液缓慢置于试管中自然凝固（37℃,2小时），吸出血清，离心后检测ECP。

　　3.支气管肺泡灌洗液(BALF)：两组豚鼠经气管插管，用0.9%生理盐水10 ml经气管注入肺内，反复抽吸3次，将抽取液以1 000 r/min，离心5～10分钟，取上清，－70℃保存。

　　4.取肺组织：冰冻切片后（6 μm）放置，－70℃保存。

　　三、实验方法

　　1.肺功能检测：(1)分组：哮喘及正常豚鼠各10只作为实验组于再次诱喘或吸生理盐水24小时后进行肺功能测定。(2)肺功能测定：豚鼠以20％乌拉坦麻醉后，两根聚乙烯导管远端分别行气管、食管插管，近端经换能接头分别连接四导生理记录仪和呼吸流速仪，行曲线记录得到肺潮气量(V_T）、气体流速(）、食管胸腔段内压，以食管胸腔段内压代替胸内压（IPP）。在IPP曲线中，取呼气等量点和吸气等量点，相应两点间的胸内压差（ΔIPP）代表气管内气体流动压差。在曲线中与之相应两点流量差（Δ）即为上述气体流动压差的流量差，此时气流阻力即为平均肺阻力（R_L）。(3)肺功能参数计算：

　　2.血浆（血清）和BALF免疫学检测：(1)血浆和BALF中可溶性细胞间粘附分子(sICAM-1)，IL-8水平：用ABC-ELISA方法。ICAM-1单克隆抗体（1 mg/ml）和IL-8单克隆抗体(1 mg/ml)购自深圳晶美生物工程公司，为美国genzyme公司产品。(2)血浆和BALF中可溶性P选择素(sP)水平：用双抗体夹心ELISA方法。试剂盒购自苏州医学院血栓与止血研究室。(3)血清和BALF中ECP水平：用荧光固定酶免疫分析方法。ECP试剂盒和CAP变应原测定仪均为瑞典Pharmacia公司产品。

　　3.肺组织（气道上皮细胞和血管内皮细胞）ICAM-1和IL-8表达：两种单克隆抗体种类同上。用ABC酶染色法检查。染色结果用VIDAS图像自动分析系统处理，血管内皮或气道上皮阳性染色面积(A1)、管腔横截面积(A)、A1/A作为分析参数。

　　4.统计学处理:所有数据均以均数和标准差表示，显著性检验采用t检验。

　　结果

　　一、肺功能变化

　　实验结果显示，哮喘组豚鼠的V_T和C_dyn较正常组明显降低，R_L较正常组明显升高，表明哮喘组豚鼠肺功能有损害(表1)。

表1　各组豚鼠肺功能变化(±s)

组别	鼠数	VT (ml)		RL(cmH2O.ml-1.s-1)		Cdyn (ml.cmH2O-1)
		±s	99%置信区间	±s	99%置信区间	±s	99%置信区间
正常对照组	10	17.3±2.1	15.1～19.5	1.05±0.66	0.22～1.88	0.24±0.18	0.14～0.34
哮喘组	10	7.1±2.2	4.8～　9.4	5.42±3.71	1.61～9.28	0.09±0.05	0.03～0.15
t值		8.314497		2.788949		3.942322
P值		＜0.01		＜0.05		＜0.01

　　注：1 mm Hg=0.133 kPa

　　二、血浆和BALF中sICAM-1、IL-8、sP选择素、ECP值

　　实验结果显示，哮喘组血浆及BALF中sICAM-1，sP选择素，ECP值均高于正常组；BALF中IL-8较正常组高，而血浆IL-8较正常组低(表2)。

表2　各组豚鼠BALF和血浆(血清)sICAM-1、IL-8、sP选择素、ECP值水平测定(±s)

组别	鼠数	sICAM-1［BALF(A值)］		sICAM-1［血浆(A值)］		IL-8［BALF(A值)］		IL-8［血浆(A值)］
		±s	99%置信区间	±s	99%置信区间	±s	99%置信区间	±s	99%置信区间
正常对照组	6	0.08±0.02	0.05～0.11	0.10±0.02	0.07～0.13	0.13±0.03	0.08～0.18	0.46±0.03	0.41～0.51
哮喘组	6	0.50±0.08	0.37～0.63	0.61±0.09	0.46～0.76	0.87±0.17	0.29～1.15	0.33±0.04	0.26～0.40
t值		12.23024		15.05713		10.31226		6.521678
P值		＜0.01		＜0.01		＜0.01		＜0.01
组别	鼠数	sP选择素［BALF(ng/L)］		sP选择素［血浆(ng/L)］		ECP［BALF(μg/L)］		ECP［血清(μg/L)］
		±s	99%置信区间	±s	99%置信区间	±s	99%置信区间	±s	99%置信区间
正常对照组	6	4.3±　0.2	4.0～　4.6	3.9±0.3	3.4～　4.4	1.3±0.2	1.0～1.6	2.2±0.3	1.7～2.7
哮喘组	6	53.0±24.0	13.5～92.5	16.5±7.4	4.3～28.7	3.9±0.7	2.7～5.1	7.6±1.4	5.3～9.9
t值		4.872339		4.308833		8.783971		9.395024
P值		＜0.01		＜0.01		＜0.01		＜0.01

　　三、各组豚鼠气道组织（上皮细胞和血管内皮细胞）ICAM-1和IL-8表达

　　实验结果表明，哮喘组豚鼠ICAM-1和IL-8在气道上皮细胞及血管内皮细胞均呈高表达，且二者有相关意义，提示IL-8具有诱导哮喘气道ICAM-1表达进而参与气道炎症作用(表3)。

表3　各组豚鼠气道组织(上皮细胞和血管内皮细胞)ICAM-1和IL-8表达率(±s)

组别	鼠数	ICAM-1［上皮细胞(%)］		ICAM-1［内皮细胞(%)］		IL-8［上皮细胞(%)］		IL-8［内皮细胞(%)］
		±s	99%置信区间	±s	99%置信区间	±s	99%置信区间	±s	99%置信区间
正常对照组	10	26±　7	14～38	26±6	16～36	15±　3	10～20	13±4	6～20
哮喘组	10	60±13	39～81	59±9	44～74	57±13	36～78	59±9	44～74
t值		9.251103		10.56227		11.28933		15.85148
P值		＜0.01		＜0.01		＜0.01		＜0.01

　　讨论

　　ICAM-1是一种细胞表面单链跨膜糖蛋白分子，通常识别中性粒细胞(PMN)、嗜酸粒细胞、单核细胞和淋巴细胞表面的淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)，亦称CD⁺_11a/CD⁺₁₈或同系物(Mac-1)亦称CD⁺₁₁₆/CD⁺₁₈，参与这些细胞与内皮细胞或上皮细胞间粘附^［2］。而P选择素又称血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白，定位于血小板的α颗粒和内皮细胞的棒管状小体内，与含有白细胞siayle-lewisx抗原(唾液酸化的氨基多糖结构)的碳水化合物结构结合，可启动白细胞沿血管内皮上滚动。Sakamaki^［3］认为血浆P选择素水平可以反映出肺血管内皮细胞与白细胞粘附能力。

　　本组研究通过对过敏原致敏豚鼠2周后再次激发24小时哮喘迟发反应（LAR），结果显示，哮喘组豚鼠与正常组豚鼠比较气道血管内皮细胞和上皮细胞ICAM-1表达上调。血浆和BALF可溶性ICAM-1水平和P选择素水平上升，表明哮喘时炎症粘附机制被激活，白细胞与内皮细胞和上皮细胞粘附增加和白细胞跨内皮能力增加，sICAM-1与模型（上皮细胞和内皮细胞）ICAM-1同步上升与哮喘时肺功能损害相一致。表明sICAM-1具有促炎能力，与Hesfeider等^［4］实验结果一致 。

　　IL-8可作为细胞间相互作用的调节分子，有报道在白细胞-内皮细胞粘附链上IL-8可以使CD^＋₁₁／CD^＋₁₈从PMN的细胞内库转移至细胞表面，同时使PMN表面的L选择素脱落并发生变形，当IL-8在血管内皮上时，以上作用使PMN与内皮细胞作用加强，并且细胞变形而游走^［5］。有证据表明，IL-8可使多核粒细胞中64 000蛋白发生磷酸化，并可使细胞游离Ca²⁺浓度增加而细胞间粘附已发现与细胞间钙离子流相关，IL-8调节Ca²⁺离子作用可能为其调节细胞间粘附机制之一^［6，7］。

　　本组实验结果显示，哮喘豚鼠较正常组豚鼠肺组织气道上皮和血管内皮细胞IL-8表达上调。Yousefei等^［8］认为内皮细胞和上皮细胞能合成IL-8，是IL-8来源之一，在抗原激发后IL-8合成释放增加。而血浆IL-8不上升,BALF中IL-8上升揭示哮喘时IL-8主要在局部炎症细胞释放并在局部炎症中发挥作用，有报道，严重哮喘时血浆IL-8可上升。除调节细胞粘附外，IL-8亦可以作为嗜酸粒细胞趋化因子，Collius等^［9］发现，IL-8对嗜酸粒细胞的趋化作用呈剂量依赖性。嗜酸粒细胞含有大量类晶体蛋白颗粒如ECP等，这些物质可以直接损伤气道上皮致气道高反应、气道痉挛，肺功能受损。我们研究结果显示，哮喘组豚鼠BALF中IL-8与BALF和血清ECP呈平行上升，表明二者呈一定的相关性，即IL-8可以使嗜酸粒细胞活化，使ECP大量释放，而ECP能进一步上调粘附分子表达形成恶性循环，故气道IL-8越高，气道嗜酸粒细胞浸润越明显，肺功能损害越严重^［10］。

　　参考文献

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(收稿：1998-08-10　　修回：1998-12-02)