内源性一氧化碳在小儿哮喘发病机制中的作用初探

中华结核和呼吸感染 1999年第4期第22卷 论　著

作者：蒋东波　史源　李华强　潘捷　沈际皋　姚忠凯　刘萍　覃世文　潘凤

单位：400042 重庆，第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所

　　关键词： 一氧化碳；哮喘；儿童

　　【摘要】　目的　探讨一氧化碳(CO)等在小儿哮喘发病机制中的作用及意义。方法　应用Chalmers血红蛋白结合及联二亚硫酸盐还原法检测了22名正常儿童、26例支气管哮喘患儿血浆CO水平，同时测定了一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平，并在动物模型上进行验证。结果　哮喘患儿急性发作期血浆CO、和TNF-α水平与对照组比较，t值分别为8.421，3.088，15.432，(P均＜0.01)，缓解期CO和水平恢复正常(P均＞0.05)，而TNF-α水平与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。哮喘患儿血浆CO与水平呈显著正相关(r=0.476，P＜0.05)，而与TNF-α相关不显著(r=0.268，P＞0.05)。过敏性哮喘豚鼠血浆CO和TNF-α水平与对照组比较，t值分别为3.694，7.454，(P均＜0.01)，而水平变化差异无显著性(P＞0.05)。过敏性哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中CO、和TNF-α水平的t值分别为3.049，5.609，5.955，(P＜0.05～0.01)。糖皮质激素组血浆及BALF中CO、和TNF-α水平差异均无显著性(P＞0.05)。过敏性哮喘豚鼠BALF中CO水平与水平呈显著正相关(r=0.897，P＜0.05)，而与TNF-α水平相关不显著(r=0.625，P＞0.05)。结论　内源性CO是在NO之外的又一个内源性介质参与哮喘的一系列病理生理过程，其生物学作用及其临床价值尚需进一步探讨。

Evidence of increased endogenous carbon monoxide production in asthma

　　【Abstract】　Objective　To investigate the role of carbon monoxide (CO) in the pathogenesis of asthma.Methods　We examined CO, nitrite and nitrate () and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) levels in plasma of 26 asthmatic children and 22 matched normal children. At the same time, we examined the plasma and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) CO, and TNF-α levels in guinea-pigs with allergic asthma.Results　Asthmatic children in acute attack stage had increased levels of CO, and TNF-α in plasma compared with normal control subjects (all P＜0.01), while in stable stage plasma CO and reduced to normal levels (both of the P＞0.05), but TNF-α was still higher than the normal controls (P＜0.01). Guinea-pigs with allergic asthma had increased amounts of CO and TNF-α in plasma and CO, and TNF-α in BALF as compared with normal control subjects (P＜0.05～0.01), but no changes in levels of circulating (P＞0.05) were found. There was no difference between glucocorticoid treated asthmatic guinea pigs and normal controls in levels of CO, , and TNF-α. The elevation of plasma CO correlated with elevated level in asthmatic children (P＜0.05), so did in the BALF in allergic guinea-pigs.Conclusions　Our present data showed that endogenously produced CO was increased during the course of asthma, which suggested that the role of CO in asthma might worth further study.

　　【Key words】　Carbon monoxide　　Asthma　　Children

　　自90年代以来，有关一氧化碳(CO)的生物学研究取得了重要进展。目前研究提示，与一氧化氮(NO)分子结构类似的CO不仅作为一种信使分子发挥重要作用，而且是又一种神经递质^［1］。它具有调节平滑肌舒张，调节血流、血压，细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)水平、细胞因子水平、NO水平、体内激素分泌，细胞及组织损伤和肿瘤免疫等复杂功能^［1-4］。所有迹象表明CO和NO一样，具有重要的生理和病理学意义。目前已成为心血管、免疫和神经科学等医学领域的一个研究热点。推测CO在支气管哮喘发病机制中可能具有重要意义。为此，我们检测了正常儿童、支气管哮喘患儿血浆CO、NO和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平，并在动物模型上进行验证，以探讨CO等在小儿哮喘发病机制中的作用及意义，为哮喘发病机制的研究提供新的研究途径。

　　对象与方法

　　一、临床研究

　　1.正常对照组：正常健康体检儿童22名，年龄2～10岁，男13名，女9名。既往均无哮喘病史，且采血前4周内无感染及用药史。

　　2.哮喘组：确诊为支气管哮喘的本院住院及门诊患儿26例，均为急性发作期患儿，男16例，女10例，年龄1～13岁。采血前4周内未口服及静脉滴注糖皮质激素及免疫增强或抑制剂等药物。其中16例患儿经糖皮质激素及支气管扩张剂等治疗，待临床症状缓解后，于出院前再次采周围静脉血待测。

　　二、动物实验研究

　　体重为200～250 g的健康豚鼠20只，雌雄各半，随机分为3组，每组5只。

　　1.哮喘组：用10%卵白蛋白腹腔注射1.0 ml将动物致敏，2周后用1%卵白蛋白超声雾化吸入致其哮喘发作，出现喘息，呼吸困难和青紫等。隔日诱喘1次，共10次，末次后于15分钟内采心脏血标本并处死动物，摘取其肺脏行支气管肺泡灌洗，即由气管内缓慢注入0.9%生理盐水2 ml，保留30秒后抽出，重复4次。每例收集支气管肺泡灌洗液(BALF)6～7 ml，置4℃离心后，取上清液待测。

　　2.肾上腺皮质激素预防(激素)组：诱喘及操作方法同哮喘组，在每次诱喘前腹腔注射氢化可的松0.5 mg/100 g。

　　3.正常对照组：用生理盐水代替诱喘剂。

　　三、方法

　　1.CO水平测定：采用Chalmers血红蛋白结合及联二亚硫酸盐还原法^［5］。

　　2.NO水平测定：采用经典的镉还原柱层析和比色法，通过检测浓度以代表NO水平^［6］。

　　3.TNF-α水平测定：采用L₉₂₉细胞株生物活性法测定^［7］。

　　四、统计学处理

　　实验数据以±s表示。组间比较用t检验，并做直线相关分析。

　　结　果

　　一、哮喘患儿血浆CO、和TNF-α水平

　　哮喘患儿急性发作期血浆CO、和TNF-α水平均显著升高，与对照组比较差异有非常显著性(t分别=8.421, 3.088, 15.432, P均＜0.01)，缓解期CO和水平恢复正常(P均＞0.05)，而TNF-α水平虽有明显下降，但仍高于对照组，差异有显著性(t=3.042, P＜0.01，表1)。

表1　哮喘患儿血浆CO、和TNF-α水平(±s)

组别	例数	CO 　　(mg/L)	(μmol/L)	TNF-α 　　(×103U/L)
对照组	22	1.08±0.14	30±3	50±15
发作组	26	1.70±0.32*	33±4*	214±48*
缓解组	16	1.12±0.13	30±3	66±17*

注：与对照组比较^*P＜0.01

　　哮喘患儿血浆CO与水平呈显著正相关(r=0.476，P＜0.05)，而与TNF-α相关不显著(r=0.268，P＞0.05)。

　　二、过敏性哮喘豚鼠血浆CO、和TNF-α水平

　　过敏性哮喘豚鼠血浆CO和TNF-α水平明显升高，与对照组比较差异有非常显著性(t分别=3.694, 7.454, P均＜0.01)，而水平变化不明显(P＞0.05)。激素组血浆CO、和TNF-α水平均无明显变化，与对照组比较差异无显著性(P均＞0.05，表2)。

表2　过敏性哮喘豚鼠血浆及BALF中CO、和TNF-α水平(±s)

组别	只数	CO 　　(mg/L)	(μmol/L)	TNF-α 　　(×103U/L)
对照组血浆	5	0.78±0.15	22.63±2.71	21± 5
对照组灌洗液	5	0.49±0.08	6.17±0.84	16± 4
哮喘组血浆	5	1.69±0.53**	21.65±2.29	77±16**
哮喘组灌洗液	5	1.14±0.47*	10.18±1.36**	51±13**
激素组血浆	5	0.82±0.16	21.46±2.83	18± 5
激素组灌洗液	5	0.46±0.05	7.22±1.15	13± 5

注：与对照组比较^*P＜0.05，与对照组比较^**P＜0.01

　　三、过敏性哮喘豚鼠BALF中CO、和TNF-α水平

　　过敏性哮喘豚鼠BALF中CO、和TNF-α水平均明显升高，与对照组比较差异有非常显著性(t分别=3.049, 5.609, 5.955, P分别＜0.05～0.01)。激素组BALF中CO、和TNF-α水平均无明显变化，与对照组比较差异无显著性(P均＞0.05)。

　　过敏性哮喘豚鼠BALF中CO水平与水平呈显著正相关(r=0.897, P＜0.05)，而与TNF-α水平相关不显著(r=0.625, P＞0.05)。

　　讨　论

　　早在60年代，Coburn等就发现人类能产生内源性CO。Tenhunen等进一步阐明，存在于微粒体的血红素氧合酶(HO)在血红素代谢中起着重要作用，作为一种限速酶，HO催化血红素分子的α甲基氧化断裂，形成等分子的胆绿素和CO。然而，CO的生物学作用和地位长期未受到重视，直到90年代初期，有关CO的生物学研究才取得了重要进展。Zayasu等^［8］首先发现哮喘患者呼出气中CO水平升高，他们认为哮喘患者呼出气中CO水平升高反映了哮喘时肺部的炎症情况。本组研究亦首次发现哮喘患儿血浆CO水平升高，过敏性哮喘豚鼠血浆及BALF中CO水平亦升高，经糖皮质激素治疗后CO水平降至正常。充分说明哮喘时CO水平的升高系内源性，CO参与了小儿哮喘的病理生理过程。哮喘时CO升高的机制尚不清楚，可能有：(1)新近研究发现肺血管内皮细胞、上皮细胞、肺泡巨噬细胞等存在诱导型HO(HO-1)，且发现HO-1是血红素降解产生CO的主要起始及限速酶，而且几乎是唯一产生内源性CO的途径。此酶易受多种因素如炎症、缺氧和细胞因子等诱导而使其活性成倍地增加，产生CO而发挥生理或病理作用^［9］。而本组同时发现哮喘时TNF-α升高，我们以前亦发现哮喘时IL-6水平升高^［10］。(2)本组还发现哮喘患儿血浆NO和过敏性哮喘豚鼠BALF中NO水平升高，且同CO密切相关。NO也可诱导HO-1的活性增加而使CO水平升高^［11］。(3)糖皮质激素可抑制CO的诱导剂如NO、TNF-α及IL-6等的产生及活性，从而降低CO水平。

　　然而CO在哮喘时的具体作用尚不清楚。Utz和Ullrich发现CO可通过激活鸟苷酸环化酶而舒张气管平滑肌，而且发现CO可降低肺血管阻力，还可参与抑制缺氧引起的肺血管收缩^［4］。由此看来CO对哮喘有有益的一面。但另一方面，Javier等报道CO可促进肺巨噬细胞生成和释放TNF-α等炎症或前炎症细胞因子^［12］。从而参与哮喘气道变应性炎症和肺上皮细胞及组织的损伤过程，进而参与气道高反应性而在哮喘发病中发挥重要作用。由此看来CO可能在哮喘发病中有双重作用，具有重要的调节功能。但哮喘时CO的确切作用及其矛盾作用的最终结果如何尚不清楚，值得深入研究。

　　本课题受第三军医大学校级科研基金资助(基金编号：980010)

　　参考文献

　　1　Marks GS, Brien JF, Nakatsu K, et al. Does carbon monoxide have a physiological function? Trends Pharmacol Rev, 1991, 12:185-188.

　　2　Verma A, Hirsch DJ, Glatt CE, et al. Carbon monoxide: a putative neural messenger. Science, 1993, 259: 381-384.

　　3　Ilano AL, Raffin TA. Management of carbon monoxide poisoning. Chest, 1990, 97: 165-169.

　　4　李华强，史源，沈际皋. 内源性一氧化碳的研究进展. 国外医学生理病理科学与临床分册，1996,16:13-15.

　　5　Chalmers AH, Simple E. Sensitive measurement of carbon monoxide in plasma. Clin Chem, 1991, 37: 1442-1445.

　　6　Shi Y, Shen JG, Wang JH, et al. Plasma nitric oxide levels in newborn infants with sepsis. J Pediatr,1993,123:435-438.

　　7　赵福生. 肿瘤坏死因子的生物活性检测. 见：钱玉昆，主编.实用免疫学新技术. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994.9：55.

　　8　Zayasu K, Sekizawa K, Okinaga S, et al. Increased carbon monoxide in exhaled air of asthmatic patients. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 156: 1140-1143.

　　9　Fukushima T, Okinaga S, Sekizawa K, et al. The role of carbon monoxide in lucigenin-dependent chemiluminescence of rat alveolar macrophages. Eur J Pharmacol, 1995,189: 103-107.

　　10　蒋东波，沈际皋，杨锡强,等. 哮喘患儿白细胞介素2、6的检测及其意义. 中华儿科杂志，1994, 32: 219-221.

　　11　Kim YM, Bergonia HA, Muller C, et al. Loss and degradation of enzyme-bound heme induced by cellular nitric oxide synthesis. J Biol Chem, 1995, 270: 5710-5713.

　　12　周海平，王学琪. 内源性一氧化碳对循环系统的调节作用. 国外医学生理病理科学与临床分册，1997, 17: 298-301.

(收稿：1998-09-02　修回：1998-12-16)