中国人支气管哮喘基因连锁标记的研究

中华结核和呼吸感染 1999年第7期第22卷 论著

作者：黄克武　刘敬忠　翁心植　朱章菱　肖白　阎梅　张洪玉　王辰

单位：100020 北京，首都医科大学附属北京红十字朝阳医院呼吸科(黄克武、翁心植、张洪玉、王辰)，基础医学研究中心(刘敬忠、朱章菱、肖白、阎梅)

　　关键词： 哮喘；遗传学；基因；连锁

　　【摘要】　目的　探索短串联重复序列-D5S436和D5S658在支气管哮喘家系连锁分析中的应用价值。方法　应用聚合酶链反应(PCR)扩增上述2个短串联重复序列，对扩增产物进行聚丙烯酰胺变性凝胶电泳检测，银染色显色分析结果。结果　92例无血缘关系的中国人中，D5S436检测到8个等位片段，22种表现型，杂合率为78%，多态信息量(PIC)为0.76；D5S658检测到9个等位片段，28种表现型，杂合率为73%，PIC为0.80。6个哮喘家系研究显示，哮喘相关性状(包括哮喘)与D5S436的最大lod值为2.490(θ=0.1时)。结论　D5S436和D5S658是两个较好的遗传连锁标记；连锁分析发现,在中国人中，支气管哮喘的易感基因可能在染色体5q31～33附近。

　　Linked marker analysis of bronchial asthma in China　　HUANG Kewu, LIU Jingzhong, WENG Xinzhi, et al. Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100020

　　【Abstract】　Objective　To study the clinical application value of genetic linkage analysis for bronchial asthma with two STRs-D5S436 and D5S658.Methods　Polymorphism of the two STRs were amplified by polymerase chain reaction, and the alleles identification were performed with denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and silver-staining techniques.Results　In 92 unrelated Chinese individuals, 8 alleles and 22 phenotypes in D5S436, 9 alleles and 28 phenotypes in D5S658 were observed. The heterozygosities were 78% and 73% respectively. The polymorphism information contents (PIC) were 0.76 and 0.80 respectively. Linkage analysis showed linkage of asthma related phenotypes (including asthma) with D5S436 on chromosome 5q (lod=2.490, θ=0.1).Conclusions　D5S436 and D5S658 were good genetic markers. Linkage analysis demonstrates that locus on chromosome 5q31～33 maybe was linked to the development of asthma in Chinese population.

　　【Key words】　Asthma　　Genetics　　Gene　　Linkage

　　支气管哮喘（简称哮喘）病因较复杂，受遗传因素和环境因素的双重影响，目前认为哮喘是一种多基因遗传疾病，以寻找哮喘候选基因为重点的哮喘分子遗传学研究，在国际上已经成为一个研究热点。Marsh等^［1］利用跨越染色体5q31～33区域的短串联重复序列(STR)对支气管哮喘家系进行连锁分析，发现该区域可能存在哮喘的易感基因。然而，不同的研究小组对不同人群的研究结果有所差异^［1-4］。在中国人群中情况如何尚未见文献报道。我们采用聚合酶链反应（PCR）-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法，结合银染色研究对位于染色体5q31～33上的D5S436、D5S658两个基因座在中国人群中的DNA多态性进行分析评价，并以其为遗传连锁标记对6例支气管哮喘家系进行连锁分析，进而对哮喘易感基因的定位进行初步探索。

　　对象与方法

　　一、对象

　　92名无血缘关系的个体血样取样于北京地区中国人群，其中男54名，女38名，年龄16～62岁。 选择北京地区呈常染色体显性遗传的6个支气管哮喘家系，并取58名家系成员3～5 ml外周血，10%依地酸二钠(EDTA)抗凝，按常规方法抽提基因组DNA^［5］。通过病史询问、乙酰甲胆碱气道反应性测定、过敏原检测和血清总IgE的测定对先证者及其家庭成员进行哮喘及相关性状的确定。

　　二、方法

　　1.DNA扩增：D5S436基因座引物序列A：5′-GTCTCCACCCACAGCAGG-3′；B：5′-TATGTGCCAGG-CATTACGCT-3′。D5S658基因座引物序列A：5′-ATTCTCTATTGGAGCCAAGCCAAG-3′；B：5′-TTTGAAG-GGCACTACGAAGATCCTC-3′(上述引物由美国Levitt博士馈赠)。

　　PCR反应体积为25 μl，其中50 ng模板DNA，0.4 μmol/L引物，1.5 mmol/L氯化镁，50 mmol/L氯化钾，200 μmol/L dNTPs 。首先94℃变性7～10 分钟，在72℃加0.5 U Taq DNA聚合酶，然后进入循环，94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，共30次循环，最后72℃延伸7分钟。

　　2．扩增片段长度多态性检测：扩增产物25 μl加50 μl载样缓冲液(含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝和95%甲酰胺)混匀后，95℃变性5分钟，迅速放入冰水骤冷，使扩增产物保持单链状态，以pBR322/MspI作为DNA分子量标准，8%聚丙烯酰胺变性凝胶，400伏特室温电泳3小时(加样前预电泳1小时)。凝胶以硝酸银染色显示扩增DNA片段，读取各个体表现型（读取家系成员的表现型在未知性状时进行），必要时辅以DNA测序予以确定。

　　3．结果分析：多态信息量(PIC)按下列公式计算：

　　其中n为该基因座的等位基因数，Pi为第i个等位基因在群体中的频率

　　4．统计学处理：采用Linkage 软件包(V5.1)中的MLINK程序计算lod值。χ²检验用于判定人群中D5S436、D5S658基因座的表现型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。

　　结果

　　D5S436、D5S658位点经PCR扩增后，应用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离DNA片段，凝胶经硝酸银染色后可显示出清晰的DNA条带，每组由2～4条带组成(图1)，等位片段在群体中显示出多态现象。由于扩增片段中CA链和GT链在聚丙烯酰胺变性凝胶电泳时泳动率不同，所以纯合子产生2条带，杂合子产生4条带。在92名无关个体中，D5S436共检测到8个等位片段，片段长度在234～248 bp之间，根据片段从小到大分别命名为A₁，A₂，A₃……A₈，共形成22种表现型，杂合率为78%，PIC为0.76。另外，观察的表现型数和期望的表现型数一致，符合Hardy-Weinberg平衡(χ² =13.76，df=7, P＞0.05)。D5S658共检测到9个等位片段，片段长度在264～280 bp之间，根据片段从小到大分别命名为B₁，B₂，B₃……B₉，共形成28种表现型，杂合率为73%，PIC为0.80。另外，观察的表现型数和期望的表现型数一致，符合Hardy-Weinberg 平衡(χ² =7.99，df=11, P＞0.05)。

图1　等位片段在群体中显示出的多态现象　　哮喘、哮喘相关性状(包括过敏性鼻炎、过敏性湿疹、血清总IgE＞150 IU、气道高反应性)在 6个哮喘家系中的分布见图2。68位成员(包括已明确性状的死亡者)中，患哮喘者21例，占31%，加上哮喘相关性状者共27例，占40%。哮喘与D5S436、D5S658之间在重组率为0.05时的lod值分别为-3.161和-1.985；哮喘加上哮喘相关性状与D5S436、D5S658之间的最大lod值分别为2.490(θ=0.1时)和0.679(θ=0.2时)。

注：实心(■●)和空心符(□○)分别代表哮喘和正常个体：??代表有支气管哮喘相关性状的个体，Ai/Aj(ij=1,2,3……8)；Bi/Bj(ij=1，2，3……9)分别代表D5S436、D5S658位点的表现型，?表示未进行DNA分析的成员

2　6个支气管哮喘家系图谱

　　讨论

　　运用连锁分析定位孟德尔遗传式疾病的致病基因以及连锁图谱的完成需要高效标记的获得。由于STR在人群基因组中出现的数目和频率不同而表现出多态性，因此这些分散排列的简单重复序列是进行连锁分析方便、有效的遗传标记^［6］。

　　Marsh等^［1］以血清总IgE为疾病表现型，利用8个标记基因座对11个高加索家系进行研究，他们用同胞配对方法分析发现，血清总IgE水平与位于染色体5q31上的5个标记基因座明显连锁。Postma等^［2］随后还发现，气道高反应性与特异质有共同遗传性，其易感基因定位在染色体5q31～33上，并可能位于D5S436至D5S658基因座附近。最近，日本学者^［7］的报告也表明，染色体5q31～33区域存在有与日本儿童哮喘和特异质有关的基因。但在另外一些人群中的研究却未发现这种连锁关系^［3，4］。这可能主要是由于人种的差异和对疾病性状的确定不一致等有关。但在中国人群中是否存在类似的连锁关系尚未见文献报道。我们首先对D5S436、D5S658两个基因座在我国无血缘关系人群中的多态性进行研究发现，D5S436、D5S658基因座在群体中显示出高度多态性，是两个较好的遗传连锁标记。随后，对中国6例支气管哮喘家系的研究发现，如果单以哮喘作为性状，则未见哮喘与D5S436、D5S658之间存在连锁关系，加上哮喘相关性状后再进行连锁分析，则发现控制哮喘相关性状的基因与D5S436基因座之间可能存在紧密连锁。根据Genome Data Base，该基因座与IL-4基因之间大约有10～12厘摩，跨越几百万个碱基对的范围，其间可能存在有300多个基因，有许多可能的基因定位在这个区域，包括编码白细胞介素4、13、5、干扰素、调节因子1和单核-巨噬细胞克隆刺激因子的基因，以及淋巴特异性的糖皮质受体1，哮喘的发病机制中可能不同程度的涉及这些细胞因子。除了上述细胞因子外，该区域内可能还有其它一些基因与支气管哮喘发病有关，如β₂肾上腺素能受体基因的多态性与哮喘的关系^［8］；近年研究还发现，位于该区域的IL-4启动子的多态性与某些特异性IgE水平也有一定程度的相关性^［9］。此外，可能还有一些未知的基因，在哮喘的发病过程中这些基因的地位如何，它们是如何相互影响的尚有待进一步研究。

　　本课题受北京市自然科学基金资助(基金编号：7972020)

　　参考文献

　　1　Marsh DG, Neely JD, Breazeale DR, et al. Linkage analysis of IL-4 and other chromosome 5q31.1 markers and total serum immunoglobulin E concentrations. Science, 1994,264:1152-1156.

　　2　Postma DS, Bleecker ER, Amelung PJ,et al. Genetic susceptibility to asthma-bronchial hyperresponsiveness coinherited with a major gene for atopy. N Engl J Med,1995,333:894-900.

　　3　Doull IJ, Lawrence S, Watson M, et al. Allelic association of gene markers on chromosomes 5q and 11q with atopy and bronchial hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med, 1996,153:1280-1285.

　　4　Blumenthal MN, Banks SS, Bleecker ER, et al. Collaborative studies on the genetics of asthma-National Heart, Lung and Blood Institute. Clin Exp Allergy,1995,2:29-34.

　　5　Liu JZ, Gao QS, Jiang Z, et al. Studies of β-thalassimia mutations in families,living in three provinces in southern China. Hemoglobin, 1989,13:585-588.

　　6　Cooperative Human Linkage Center (CHLC). A comprehensive human linkage map with centimorgan density. Science, 1994,265:2049-2051.

　　7　Noguchi E, Shibasaki M, Arinami T, et al. Evidence for linkage between asthma/atopy in childhood and chromosome 5q31-q33 in a Japanese population. Am J Respir Crit Care Med,1997,156:1390-1393.

　　8　Reihsaus E, Innis M, Maciltyre N,et al. Mutations in the gene encoding for the β₂-adrenergic receptor in normal and asthmatic subjects. Am J Respir Cell Mol,1993,8:334-337.

　　9　Walley AJ, Cookson WOCM. Investigation of an interleukin-4 promoter polymorphism for associations with asthma and atopy. J Med Genet,1996,33:689-693.

(收稿：1998-11-29　　修回：1999-02-02)