抗CD+4人-鼠嵌合抗体对哮喘患者淋巴细胞增殖和凋亡的影响
中华结核和呼吸感染 1999年第8期第22卷 论著
作者：薛建敏 徐永健 张珍祥 熊盛道
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸内科(薛建敏现在山西医科大学附属第一医院呼吸科，030001)
关键词： 哮喘；淋巴细胞；增殖；凋亡；抗CD+4人-鼠嵌合抗体
【摘要】 目的 观察抗CD+4人-鼠嵌合抗体对哮喘发作期患者外周血淋巴细胞体外增殖及凋亡的作用。方法 取哮喘患者外周血淋巴细胞,分别加入50 mg/L、100 mg/L抗CD+4人-鼠嵌合抗体, 采用流式细胞仪及原位末端标记法观察其对经抗CD+3单抗诱导的体外培养0、24、48小时淋巴细胞凋亡的影响,同时采用四甲基偶氮唑盐（MTT）微量比色法观察其对淋巴细胞增殖的影响。 结果 哮喘患者淋巴细胞经抗CD＋ 3单抗诱导培养24小时(3.3±0.7)%及48小时（5.2±1.5)%凋亡细胞阳性率与正常人24小时(6.5±3.3)%、48小时（8.9±3.0）% 比较，差异有显著性（P＜0.05）； 淋巴细胞增殖反应(0.290±0.013)与正常组(0.220±0.015)比较差异有显著性（P＜0.05）；50 mg/L、100 mg/L抗CD＋4人-鼠嵌合抗体均可显著增加哮喘患者淋巴细胞凋亡数量［50 mg/L：24小时为（14.20±2.20）%，48小时为（33±4）% ;100 mg/L：24小时为（21±5）%,48小时为（40.0±2.7）%］，两者比较差异有显著性(P均＜0.01); 并明显抑制正常组［50 mg/L:（0.170±0.011）%;100 mg/L（0.140±0.012)%］及哮喘患者［50 mg/L：(0.265±0.010)%;100 mg/L：（0.238±0.020)］的淋巴细胞增殖反应(P均＜0.01),在哮喘患者中的作用呈剂量依赖性(r=0.642,P＜0.05),较大剂量者可使哮喘患者淋巴细胞的增殖接近于正常人的增殖水平。结论 哮喘患者外周血淋巴细胞经抗CD+3单抗诱导的增殖反应增高而凋亡减少,构建抗CD+4人-鼠嵌合抗体，可通过抑制哮喘T细胞增殖,促进T细胞凋亡,发挥免疫调节作用。
Effects of anti-CD+4 human/murine chimeric antibody on the proliferation and apoptosis of lymphocyte in patients with asthma
XUE Jianmin, XU Yongjian, ZHANG Zhenxiang
Department of Respiratory Disease, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To investigate the effects of anti-CD+4 human/murine chimeric antibody on the proliferation and the apoptosis of peripheral blood lymphocytes (PBL) in patients with asthma. Methods PBL isolated from patients with asthma were cultured with 50 mg/L、100 mg/L anti-CD+4 human/murine chimeric antibody and anti-CD+3 McAb (10 mg/L) for 0, 24, 48 h in vitro, the apoptosis cell percentage were detected by flow cytometry and in situ end-labeling technique of fragmental DNA as well as the proliferation of PBL were detected by MTT method. Results Comparing with normal controls, the apoptosis cell percentage was significantly decreased by stimulation with anti-CD+3 McAb for 24 h and 48 h, the proliferation of lymphocyte was increased in patients with asthma; the apoptosis cell percentage of patients with asthma was significantly increased (P＜0.01, respectively) with the cell cultured with 50 mg/L or 100 mg/L anti-CD+4 human/murine chimeric antibody for 24 h or 48 h At the same time the lymphocyte proliferation was inhabited (P＜0.01,respectively). Conclusions It is demonstrated that the proliferation of PBL in patients with asthma were increased and the apoptosis cell percentage were decreased, anti-CD+4 human/murine chimeric antibody had inhibited the proliferation of T lymphocyte and had enhanced the T lymphocyte apoptosis . The anti-CD+4 human/murine chimeric antibody may be potentially useful for the biotherapy of asthma.
【Key words】 Asthma Lymphocyte Proliferation Apoptosis Anti-CD+4 human/murine chimeric antibody
近年研究证实，在支气管哮喘(哮喘)的气道慢性非特异性炎症中淋巴细胞尤其是T淋巴细胞活化起关键作用。其中CD+4辅助T细胞2(Th2)的激活为主要发病环节。因此,调节CD+4淋巴细胞的数目及功能是治疗哮喘的有效途径之一。此外,炎性病变组织中浸润的淋巴细胞等炎性细胞的凋亡是炎症消散的关键, 对凋亡过程的促进亦成为治疗这类炎性病变的重要思路。抗CD+4单抗已用于免疫抑制治疗,可改善类风湿关节炎等自身免疫性疾病的病情［1］, 但国内有关其在哮喘中的研究尚少报道。我们的研究通过观察抗CD+4人-鼠嵌合抗体对哮喘发作期患者外周血淋巴细胞在体外培养条件下，T淋巴细胞增殖反应及对淋巴细胞凋亡的影响, 探讨抗CD+4人-鼠嵌合抗体对哮喘CD+4阳性细胞作用的生物效应。
对象与方法
一、药品与试剂
抗CD+4人-鼠嵌合抗体、抗人CD+3单克隆抗体(anti-CD+3 McAb) 由同济医科大学实验中心免疫室沈关心教授惠赠,四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma产品,RPMI 1640培养粉为美国Gibco产品。原位末端标记法检测细胞凋亡试剂盒为德国Boehringermannheim公司产品, 流式细胞仪为美国Becton Dickinson产品。
二、研究对象
急性发作期哮喘组患者10例,男4例,女6例,年龄20～54岁,平均年龄35岁,均为本院门诊就诊患者，符合1997年全国哮喘会议诊断标准。健康对照组10名,男5名,女5名,年龄23～50岁,平均年龄32岁，均为本院健康献血员。
三、方法
1.外周血淋巴细胞的分离：无菌取静脉血10 ml, 肝素抗凝, 加等量葡萄糖磷酸盐缓冲剂(GKN)洗液稀释,以等体积置于淋巴细胞分离液上, 2 000 r/min，离心20分钟, 收集界面细胞,以GKN洗液洗涤3 次后，台盼蓝染色活细胞比＞95%。
2.外周血淋巴细胞培养及抗CD+4人-鼠嵌合抗体对T淋巴细胞增殖反应的影响：将淋巴细胞用含10%胎牛血清(Fbs)的RPMI 1640调至细胞浓度1×109/L,取10 μl接种于96孔培养板,每孔均加入终浓度为10 mg/L的抗CD+3单抗作为T细胞增殖刺激剂, 然后分别加入0、50 mg/L, 100 mg/L的抗CD+4人-鼠嵌合抗体, 同时设两复孔及用等体积RPMI 1640代替抗CD+3单抗及嵌合抗体的对照孔,于5% CO2、37℃培养箱内培养72小时,采用MTT比色微量分析法测定T细胞增殖反应。结果以吸光度(A值,曾称光密度OD)表示, 增殖反应净增殖值＝刺激值均值－自发增殖均值。
3.抗CD+4人-鼠嵌合抗体对哮喘患者外周血淋巴细胞凋亡的影响：用含10%胎牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度至1×109/L,接种于24孔细胞培养板中,每孔1 ml,分别加入终浓度0、50 mg/L、100 mg/L抗CD+4人-鼠嵌合抗体, 每孔加入抗CD+3单抗10 mg/L 于37℃、5% CO2培养箱中培养0(基线值)、24、48小时，培养细胞分别采用流式细胞仪及原位末端标记(TUNEL法)检测淋巴细胞发生凋亡情况。
4.流式细胞仪检测：收集不同细胞分别调至浓度为1×109/L淋巴细胞悬液,用磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.2)稀释,1 000 r/min，每次5分钟,共2次, 经核糖核酸（RNA）酶消化后, 加入含50 mg/L的碘化丙啶(PI)混合，4℃ 1小时,上流式细胞仪检测。
5.TUNEL法检测外周血淋巴细胞凋亡：细胞凋亡的典型表现是基因组DNA在内源性核酸内切酶的作用下降解成核小体片段。TUNEL法的原理是利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的特性, 将生物素标记的尿嘧啶连接到单链或双链DNA片段的自由末端上,可较精确的定量检测细胞凋亡,具体实验步骤参照文献报道方法进行［2］。光学显微镜下观察,每实验孔制备3张涂片,每张涂片随机选择5个视野,计数200个细胞,计算凋亡阳性细胞百分率,以3张涂片的均数作为结果。
图1 凋亡信号阳性细胞碱性磷酸酶显色于胞核，细胞固缩 TUNEL ×400
图2 抗CD+ 4人-鼠嵌合体(50 mg/L)刺激哮喘患者淋巴细胞48小时凋亡细胞增加 TUNEL ×100
图3 抗CD+ 4人-鼠嵌合抗体(100 mg/L)刺激哮喘患者淋巴细胞48小时凋亡细胞较50 mg/L者增多 TUNEL ×100
统计学处理：数据均以
±s,采用配对t检验或方差分析及q检验。
结果
一、抗CD+4人-鼠嵌合抗体对外周血淋巴细胞增殖反应的影响
哮喘组抗CD+3单抗刺激的淋巴细胞活化增殖反应0.290±0.013较正常对照组0.220±0.015明显增强(P＜0.05); 50 mg/L和100 mg/L抗CD+4人-鼠嵌合抗体可明显抑制抗CD+3单抗刺激的正常对照组(0.170±0.011、0.140±0.012)和哮喘组(0.265±0.010、0.238±0.020)淋巴细胞活化增殖，不同剂量抗CD+4人-鼠嵌合抗体对每组的作用差异均有显著性(P均＜0.01)；每组中100 mg/L抗CD+4人-鼠嵌合抗体的抑制作用强于50 mg/L者(P均＜0.05),该剂量下哮喘组的增殖反应接近正常对照组单用抗CD+3单抗刺激者(表1)。
表1 抗CD+4人-鼠嵌合抗体对外周血淋巴细胞增殖的影响(A值，±s)
| 组别 |
例数 |
抗CD+3单抗 |
抗CD+3单抗+抗CD+4
人-鼠嵌合抗体
(50 mg/L) |
抗CD+3单抗+抗CD＋4
人-鼠嵌合抗体
(100 mg/L) |
F值 |
P值 |
| 正常对照组 |
10 |
0.220±0.015 |
0.170±0.011* |
0.140±0.012** |
88. 31 |
＜0.01 |
| 哮喘组 |
10 |
0.290±0.013 |
0.265±0.010* |
0.238±0.020** |
48.67 |
＜0.01 |
注：方差分析q检验,与单加抗-CD+3-McAb 10 mg/L比较 *P＜0.01;与抗CD+3 McAb mg/L加50 mg/L抗CD+4人-鼠嵌合抗体比较**P＜0.01
表2 抗CD+4人-鼠嵌合抗体对淋巴细胞凋亡的影响(%，
±s)
| 组别 |
例数 |
抗CD+3单抗 |
抗CD+3单抗+抗CD+4
人-鼠嵌合抗体(50 mg/L) |
抗CD+3单抗+抗CD+4
人-鼠嵌合抗体(100 mg/L) |
| 0h |
24h |
48h |
0h |
24h |
48h |
0h |
24h |
48h |
| 哮喘组 |
10 |
1.8±0.4 |
3.3±0.7 |
5.2±1.5 |
2.00±0.60 |
14.20±2.20* |
33±4* |
2.10±0.90 |
21±5*△ |
40.0±2.7*△ |
| 正常组 |
10 |
1.9±0.4 |
6.5±3.3 |
8.9±3.0 |
2.00±0.40 |
16.40±3.40* |
39±5* |
1.90±0.70 |
22±4* |
45.0±6.0* |
注：方差分析q检验与单加抗CD+3-McAb 10 mg/L比较 *P＜0.01;与抗CD+3-McAb 10 mg/L＋抗CD+4人-鼠嵌合抗体50 mg/L比较，△P＜0.01 二、哮喘组外周血淋巴细胞凋亡及抗CD+4人-鼠嵌合抗体对其影响
TUNEL法检测结果显示,细胞涂片碱性磷酸酶(AP)显色凋亡细胞呈紫兰色,高倍镜下见凋亡细胞AP显色主要在胞核, 细胞核固缩裂解为主要征象(图1)。哮喘组外周血淋巴细胞在抗CD+3单抗刺激下培养24小时凋亡细胞阳性率为(3.3±0.7)%及培养48小时凋亡细胞阳性率为(5.2±1.5)%，均分别较相应时间正常对照组凋亡细胞阳性率(6.5±3.3)%，8.9±3.0)%降低，差异有显著性(P均＜0.01)。哮喘组外周血淋巴细胞在抗CD+3单抗激活后加入不同浓度抗CD+4人-鼠嵌合抗体时, 凋亡细胞阳性率(24、48小时)均分别较单加抗CD+3单抗者显著增高(24小时F值=51.36，48小时F值=250.75，P均＜0.01)，且同一时间下100 mg/L者明显高于50 mg/L者，差异有显著性(P均＜0.01，表2，图2，3)。同时，随抗CD+4人-鼠嵌合抗体剂量增加及作用时间的延长正常组凋亡率也增加，差异有显著性(P均＜0.01)，与对哮喘患者的作用趋势一致，即抗CD+4人-鼠嵌合抗体对人的淋巴细胞均有促凋亡作用。
三、流式细胞仪检测
流式细胞仪测得哮喘患者外周血淋巴细胞经抗CD+3单抗刺激体外培养时,加入不同浓度抗CD+4人-鼠嵌合抗体作用 24及48小时均可诱导凋亡细胞显著增加,在凋亡时间、流程上与原位末端标记法方向一致(图4),并在G1期前均有亚二倍体峰,即凋亡峰出现(图5)。
图4 两种不同检测方法示100 mg/L抗CD+4人-鼠
嵌合抗体组不同时间凋亡细胞变化
图5 流式细胞仪检测示G1期前有亚二倍体峰，
即凋亡峰出现
讨论
细胞的增殖和凋亡过程达到动态平衡是维持机体自身恒定的必要条件。凋亡过度或不足都会引起细胞数量及功能失衡而导致疾病。近年提出T 细胞凋亡减少可能与某些自身免疫性疾病的发生有关［3］,但有关哮喘中淋巴细胞凋亡的研究尚少。抗CD+3单抗能经T细胞受体(TCR)-CD+3分子途径刺激T淋巴细胞活化增殖［4］,本组结果显示, 哮喘患者抗CD+3单抗刺激下外周血淋巴细胞增殖反应较正常组增强,而淋巴细胞在抗CD+3单抗刺激后凋亡(即激活引起的细胞死亡) 细胞百分率较正常组减少, 两者的总效应是一致的, 均可能是哮喘患者T淋巴细胞功能亢进的原因。
Spinozzi等［5］新近研究也证实, 哮喘患者T淋巴细胞Fas基因表达减低,同时白细胞介素4(IL-4)可下调哮喘患者T细胞表面Fas基因及Fas配体的表达, 认为淋巴细胞凋亡减少可能是哮喘气道炎症持续存在的原因之一。
CD+4 T细胞在哮喘中的过度活化，使其可能成为抗体导向治疗及免疫调节的一个靶点。Gavett等［6］研究证实，在抗原所致的小鼠过敏性气道炎症模型中，利用抗CD+4单克隆抗体可以完全阻止气道高反应性及气道嗜酸性粒细胞浸润, 但在哮喘患者中的应用目前尚未见报道。同时由于此单抗为鼠源性,对人体有异种蛋白的免疫原性,人体内多次使用可产生抗鼠抗体和过敏反应等,也防碍了其在临床应用。本校实验中心免疫室通过基因工程技术改造鼠源性单抗,将引起异种蛋白反应的鼠源性免疫蛋白的恒定区(C区)替换为人源的,单抗与抗原特异结合的可变区(V区)仍保留,由此构建了人-鼠嵌合抗体［7］。本组实验观察到，此构建的抗CD+4人-鼠嵌合抗体可以明显抑制正常人和哮喘患者外周血淋巴细胞体外培养时抗CD+3单抗诱导的增殖反应,并呈剂量依赖性, 较大剂量可使哮喘患者淋巴细胞增殖率下降至接近于正常组单用抗CD+3单抗刺激时的增殖水平,与国外文献报道相符［8］,即抗CD+4 单抗可以抑制CD+4 T细胞对抗原刺激的激活及抑制混合淋巴反应。人CD+4分子为细胞膜表面单链糖蛋白,主要分布于部分T淋巴细胞和胸腺细胞表面,CD+4分子最主要的功能是参与TCR/CD+3识别的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子相互作用,参与T细胞激活。应用抗CD+4分子的抗体与CD+4分子结合,可能通过干扰T细胞对抗原的识别和T细胞的激活而抑制CD+4 T细胞的功能［9］,从而清除循环血中过多的CD+4 T细胞或通过抗体的封闭作用达到治疗目的。同时我们应用流式细胞仪及末端终止法检测均证实, 此构建抗体可明显促进哮喘患者淋巴细胞抗CD+3单抗激活后的凋亡,这与Choy等［10］结果一致, 他们证实抗CD+4人-鼠嵌合抗体可以直接促进结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)诱导的外周血单个核细胞凋亡,认为此作用可能是通过Fc-γ受体阳性细胞结合而实现。因此, 此构建的抗CD+4人-鼠嵌合抗体可以通过改变哮喘患者T淋巴细胞的激活反应并促进T淋巴细胞凋亡而发挥免疫抑制作用,协调哮喘患者体内T淋巴细胞增殖和凋亡的动态平衡,可望从分子水平阻断炎症的形成,开辟哮喘免疫治疗的新领域。
参考文献
1 Horneff G, Burinester GR, Emmerrich F, et al. Treatment of rheumatoid arthritis with an anti-CD+4 monoclonal antibody. Arthritis Rheum, 1991,34:129-133.
2 Nonclereq D, Reverse D, Toubeau G, et al. In situ demonstration of apoptotic germ cells in an experimental model of chemical castration.Boichemica, 1997,1:12-15.
3 Wu JG, Zhou T, Zhang JJ, et al. Correction of accelerated autoimmune disease by early replacement of the mutated lpr gene with the normal Fas apoptosis gene in the T cells of transgenic MRI-lpr/lpr mice. Proc Natl Aced Sci USA, 1994,91:2344-2348.
4 Katayame Y, Miyazaki S, Oshimi Y, et al. Ca2+ reaponse in signle human T cell induced by stimulation of CD+4 or CD+8 and interference with CD+3 stimulation. J Immunol Meth, 1993,166:145-153.
5 Spinozzi F, Fizzotti M, Agea E, et al. Defective expression of Fas messenger RNA and Fas receptor on pulmonary T cells from patients with asthma. Annal Intern Med, 1998,128:363-369.
6 Gavett SH, Chen X, Finkelman F, et al. Deleption of murine CD+4 lymphocytes prevents antigen-induced airway hyperreactivity and pulmonary eosinophilia. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994,10:587-593.
7 Shen GX, Zhu ZG, Zhu HF, et al. Expression of anti-CD+4 human/murine chimeric antibody and their killer tumor activity. J Tongji Med Univ,1998,18:1-4.
8 Inaba K, Steinman RM, Theze J, et al. Monoclonal antibodies to LFA-1 and to CD+4 inhibit the mixed leukocyte reaction after the antigen-dependent dustering of denelritic cells and T lymphocyte. J Exp Med, 1987, 165:1403-1411.
9 Morel P, Vincet C, Wijdens J, et al. Down-regulation of cell surface CD+4 molecule expression induced by anti-CD+4 antibody in human T lymphocytes. Cellular Immunol, 1991, 145:287-298.
10 Choy EH, Adjaye J, Forrest L, et al. Chimaeric anti-CD+4 monoclonal antibody cross-linked by monocyte Fc gamma receptor mediates apoptosis of human CD+4 lymphocytes. Eur J Immunol, 1993,23:2676-2681.
收稿：1998-12-24
修回：1999-03-30
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