哮喘患者外周血淋巴细胞蛋白激酶C活性变化的研究

中华结核和呼吸感染 1999年第8期第22卷 论著

作者：刘先胜　徐永健　张珍祥　熊盛道　刘晓晴　刘建　刘谨

单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸内科

　　关键词： 哮喘；淋巴细胞；蛋白激酶C

　　【摘要】　目的　研究哮喘患者外周血淋巴细胞蛋白激酶C(PKC)活性的变化及其与气流受限程度的关系。方法　从18例哮喘患者和6名正常对照组的外周静脉血中分离和纯化淋巴细胞胞浆及胞膜部分PKC, 然后采用同位素γ-³²P-ATP 催化活性测定法检测它们的活性。结果　(1)哮喘患者淋巴细胞PKC的总活性较健康对照组明显增强(P＜0.01),胞膜PKC的活性明显升高(P＜0.05),各哮喘组胞膜部分PKC活性占总活性的百分比值与正常对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。体外实验表明,(1)乙酰甲胆碱组(5例)或组胺组(5例)均可明显促进淋巴细胞胞浆PKC的转位(P＜0.05),从而激活PKC；(2)淋巴细胞PKC的总活性与患者气流受限的程度有密切关系。PKC的总活性与一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁占预计值％）呈显著负相关(r=-0.73,P＜0.001,18例); 与气道峰值流速(PEF)呈显著负相关(r=-0.62,P＜0.01,18例);与 50％ 肺活量时的用力呼气流速(₅₀)呈显著负相关(r=-0.63, P＜0.01,18例);(3) 哮喘患者淋巴细胞PKC 活性与血清可溶性白介素2受体（sIL-2R）浓度呈显著正相关(r=0.58,P＜0.05,18例)。结论　(1) 哮喘患者外周血淋巴细胞PKC总活性及其活化程度较健康组显著增强,PKC的异常激活可能与炎症介质的释放增加有关;(2)哮喘患者外周血淋巴细胞PKC总活性与气流受限程度有显著相关关系;(3)PKC 通道可能参与T淋巴细胞的活化过程。 提示PKC信号转导途径在哮喘的发病机制中可能具有一定的意义。

The changes of protein kinase C activity in peripheral blood lymphocytes in asthmatic patients

LIU Xiansheng, XU Yongjian, ZHANG Zhenxiang

Department of Respiratory Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan,430030

　　【Abstract】　Objective　To investigate changes of protein kinase C (PKC) activities in peripheral blood lymphocytes (PBL) and the relationship between PKC activities and level of the air flow limitation in asthmatic patients. Methods　PKC from cytosolic and membrane fractions of PBL was isolated and purified, then its activities were determined. Results　(1) The total PKC activities in PBL in asthmatic subjects (n=18)were significantly increased as compared to those in normal subjects (n=6,P＜0.01). More over, the membrane PKC activities and their percentages in the total PKC activities were higher in asthmatics than in normals (P＜0.05). In vitro it suggested that methacholine(n=5)or histamine (n=5) could significantly increase translocation of PKC from cytosol to membrane (P＜0.05) and, by doing so,activate the PKC in PBL. (2) The total PKC activities were significantly correlated with FEV₁％(r=-0.73,P＜0.001,n=18),PEF(r=-0.62,P＜0.01,n=18)and ₅₀(r=-0.63, P＜0.01,n=18). (3) The total PKC activities in PBL were significantly correlated with the levels of sIL-2R in serum in the asthmatics (r=0.58, P＜0.05,n=18). Conclusions　(1) The total activities and the level of translocation of PKC were significantly increased in PBL in asthmatics as compared to normals. This abnormal activation state of PKC in PBL may be related with the increased levels of inflammatory mediators. (2) Highly significant correlations existed between the total PKC activities and the level of air flow limitation in asthmatics. (3) PKC signal pathway may be implicated in the activation of T-lymphocytes in asthma. It is suggested that the role of PKC signal pathway may be important in the pathogenisis of asthma.

　　【Key words】　Asthma　　Lymphocytes　　Protein kinase C

　　哮喘的发病机制至今尚未完全阐述清楚。以往的研究认为，淋巴细胞在哮喘气道慢性炎症反应的启动及形成过程中有至关重要的作用^［1］。蛋白激酶C(PKC)通道是近年来发现的一条重要的细胞内信号转导通道, 研究表明，淋巴细胞中至少有11种PKC亚型分布,参与调节淋巴细胞的多种生理功能^［2］。但是,有关哮喘发病中淋巴细胞内PKC信号转导机制及其与淋巴细胞的功能和哮喘病情变化关系的研究目前尚不多见。我们就该问题进行研究, 以探讨PKC信号通道在哮喘发病中的意义, 为进一步阐明哮喘的发病机制提供新的思路。

　　对象与方法

　　一、对象

　　哮喘组18例,男10例,女8例,年龄33±6岁, 无吸烟史，受试前至少1个月内未使用过糖皮质激素，均符合支气管哮喘诊治方案的诊治标准^［3］,按照患者的病史及其一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁占预计值％）,将患者分为3组即：轻度组6例，男2例，女4例， FEV₁占预计值％＞80％；中度组6例，男4例, 女2例，FEV₁占预计值％＜80％或＞60％; 重度组6例，男4例, 女2例，FEV₁占预计值％＜60％。其中轻度组为临床缓解期患者，中、重度组为活动期患者，另以6名正常人的外周血作为对照，男4名，女2名，年龄32±8岁。

　　二、方法

　　PKC活性的测定参照文献报道的方法进行^［4］。(1)血样采集及淋巴细胞的分离:抽取受试者外周静脉血10 ml, 置于肝素化(30 IU/ml)的无菌试管中, 以等体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS,pH值为7.4,实验室自配)稀释，再加于等体积的淋巴细胞分离液(上海生物化学制剂厂)上,1 000 r/min，离心25分钟,然后用细胞采集器收集试管中间的一层乳白色的液体即为淋巴细胞，加入0.85％的氯化胺以破碎红细胞,继续用PBS稀释洗涤2次,用锥虫蓝排除法检测细胞的活性＞97％。(2)粉碎淋巴细胞:将分离出来的淋巴细胞悬浮于超声缓冲液A中,其成分为: 25 mmol/L Tris HCL, 2 mmol/L EGTA, 2 mmol/L EDTA, 2 mmol/L二硫苏糖醇,1 mmol/L苯甲基磺酰氟,250 mmol/L葡萄糖(以上各种试剂均购于武汉华美生物工程公司),在冰浴中,用超声细胞粉碎仪(Kontes,美国)粉碎淋巴细胞,每次持续30秒,间隔30秒，共处理4次。(3)PKC的提取：PKC的提取分为胞浆及胞膜两个过程。将超声粉碎后的淋巴细胞匀浆液经超速离心机(美国Beckman, Optima L-90K)超速离心(35 000 r/min 60分钟,4℃),取上清液即为胞浆可溶PKC粗提液;沉淀部分中加入含有0.3％Triton(辛基苯氧基聚乙氧乙醇)X-100的缓冲液A中,4℃条件下震荡60分钟后,再次离心(35 000 r/min，60分钟,4℃),取上清液即为胞膜PKC的粗提液。(4) PKC的纯化:将粗提液加入经缓冲液平衡后的1 ml DEAE-纤维素柱(美国Sigma公司)内, 用4倍体积的缓冲液过柱,洗脱非结合蛋白,然后用140 mmol/L NaCL缓冲液4 ml洗脱,收集洗脱液待测。(5)PKC活性的测定:反应液(pH=7.5)的成份：25 mmol/L Tris HCL, 10 mmol/L MgCL₂, 0.5 mmol/L CaCl₂, 1 g/L组蛋白(Ⅲ-S型,美国sigma公司),0.06 g/L 磷酯酰丝氨酸(PS,美国Sigma公司)，0.004 g/L 二酰基甘油(DAG,美国Sigma公司), 0.1 mmol/L γ-³²P-ATP(北京亚辉生物技术有限公司),0.2 mg 酶蛋白；反应自加入ATP开始,最后加入15％的三氯醋酸以终止反应；采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离底物组蛋白区带，测定³²P掺入组蛋白的放射性,计算出PKC的活性(单位为μmol^。min^-1。g^-1),胞浆及胞膜PKC活性均以所测的实际活性与未加DAG与PS时所得的活性之差表示, 细胞PKC总活性为胞浆及胞膜PKC活性之和。

　　乙酰甲胆碱(Mch)及组织胺(HT)对淋巴细胞PKC活性的影响:取5名正常人外周血各2份,按上述的方法,分离出淋巴细胞,将其悬浮于0.5 ml的Hanks平衡液中, 加入100 nmol/L Mch或者100 nmol/L HT,孵育10分钟后,2 000 r/min，离心2分钟，再用PBS冲洗2次,最后测定细胞胞浆及胞膜PKC的活性。

　　1.sIL-2R的测定: 参照文献采用酶联免疫吸附(ELISIA)试验进行^［5］。试剂盒由德国宝灵曼公司提供。

　　2.蛋白质含量的测定:用Lowary法^［6］测定。

　　3.肺功能的测定: 采用呼吸功能测定仪(美能达AS-300,日本)测定。

　　统计学处理:所有数据均用±s表示。组间差异采用t检验，P＜0.05为差异有显著性。两组间相关性采用直线相关分析。

　　结果

　　一、正常组及哮喘组PBL中PKC活性的变化

　　与正常对照组比较，各哮喘组PKC总活性（PKC_t）、胞膜PKC活性（PKC_m）及胞浆PKC活性（PKC_c）均明显增强,其中胞膜PKC占PKC总活性的百分比亦明显提高(表1)。

表1　哮喘患者PBL的PKC活性的变化(±s)

　　注：与正常组比较^△P＜0.05；^*P＜0.01

表2　Mch及HT对正常对照组PBL的PKC活性的影响(±s)

　　注:与对照组比较^△P＜0.05二、Mch及HT体外对正常人PBL中PKC活性的影响

　　体外实验表明,PBL经Mch及HT处理后，其胞膜PKC活性及其占总活性的百分比较对照组均明显升高；胞浆PKC活性减弱，但差异无显著性（P＞0.05，表2)。

　　三、哮喘组淋巴细胞PKC总活性与气流受限程度的关系

　　PKC总活性与FEV₁占预计值％呈显著负相关（r=-0.73,P＜0.001）; 与最大呼气流量(PEF)呈显著负相关(r=-0.62,P＜0.01); 与50%肺活量时的用力呼气流速(₅₀)呈显著负相关(r=-0.63,P＜0.01)。

　　四、哮喘组血清sIL-2R浓度及其与气流受限程度的关系

　　轻度哮喘组血清SIL-2R浓度为(289±79)×10³ U/L，与正常对照组(210±55)×10³ U/L比较，差异无显著性(P＞0.05)。 中、重度组均明显升高，分别为(428±54)×10³ U/L、(512±130)×10³ U/L(P＜0.05)。在各组哮喘患者中，血清sIL-2R浓度与FEV₁占预计值％呈显著负相关（r=-0.75, P＜0.001）;与PEF呈显著负相关（r=-0.52,P＜0.05）。

　　五、淋巴细胞PKC总活性与血清sIL-2R浓度的关系

　　淋巴细胞PKC总活性与血清sIL-2R浓度之间呈显著正相关（r=0.58，P＜0.05)。

　　讨论

　　PKC通道是一条重要的细胞内信号转导通道, 以往的研究表明,PKC在哮喘的发病机制中可能有重要的意义,如促进气道平滑肌的增生,促进气道粘液的分泌等。但是有关该通道在哮喘发病中作用的临床研究资料尚很少见。本组试验表明，在各哮喘组患者中外周血淋巴细胞PKC总活性均较正常对照组明显升高, 而且与患者肺功能FEV₁占预计值％、PEF及₅₀值均呈显著负相关，这些结果从临床研究的角度提示，PKC通道可能参与哮喘发病的病理生理过程,外周血淋巴细胞PKC活性的检测在临床病情的评估中可能具有一定的参考意义。

　　静息情况下,PKC大多位于细胞的胞浆部分,胞膜中含量很少,当细胞受到某些刺激(如抗原或某些炎症介质)之后,胞膜中的磷酯发生崩解而产生二酰基甘油(DAG),激活胞浆中的PKC,使其从胞浆转位至胞膜,这种转位是PKC活化的重要标志^［7］。有研究认为, 胞浆中若超过5％的PKC转位至胞膜, 便足可提示PKC及淋巴细胞的活化^［8］。本组试验发现，与健康对照组比较,哮喘患者的淋巴细胞中超过7％的胞浆PKC发生转位,其胞膜PKC活性占细胞PKC总活性的百分比显著升高。Bansal等^［9］在研究中也曾得到类似的结果。该结果提示哮喘患者淋巴细胞PKC被激活的程度较正常对照组明显提高,进一步显示了PKC通道在哮喘发病中可能具有的作用。

　　体外实验表明,参与哮喘炎症反应的组织胺及乙酰胆碱均可促进淋巴细胞PKC的转位及活化,因此我们推测,患者外周血淋巴细胞PKC的异常活化可能与哮喘发病时炎症介质的释放增加有关。但是在哮喘发病过程中,PKC的这种异常活化与细胞本身的功能变化是否存在某种联系目前尚不明了。为此我们探讨了它与血清中sIL-2R的关系。sIL-2R是一种可溶性的白细胞介素受体,表达于外周血T淋巴细胞后脱落至血清而形成,它是T淋巴细胞活化的重要标志^［10］。在哮喘患者中,血清sIL-2R水平较正常对照组增高,且与气道的功能状态有密切关系^［5］,本组试验也证明了这点。结果表明，PKC的总活性与血清中的sIL-2R水平呈显著正相关。提示在哮喘发病中,PKC可能与T淋巴细胞的活化有关。

　　综上所述,在哮喘发病中,炎症介质的释放增多有可能使淋巴细胞PKC被异常激活,PKC的活性与T淋巴细胞的活化及患者气道气流受限的程度密切相关, 提示PKC信息通道在哮喘的发病机制中可能具有重要的意义。继续在该领域进行深入研究,对于从细胞内生物信号传导方面阐明哮喘的发病机制,进而探讨新的治疗途径将具有积极意义。

　　志谢　中科院水生生物研究所杨仲安、同济医院中心实验室陶德定及同济医科大学生化教研室胡圆圆同志在实验过程中所提供指导，特致谢

　　参考文献

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收稿：1999-01-29

　　修回：1999-04-28