哮喘患者痰液中亚硝酸盐/硝酸盐含量的变化及其意义
中华结核和呼吸感染 1999年第8期第22卷 论著
作者：王瑜 王辰 童朝晖 庞宝森 马力 李氢元
单位：100020 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院呼吸疾病医疗研究中心
关键词： 哮喘；痰；一氧化氮；嗜酸细胞阳离子蛋白
【摘要】 目的 探讨痰液中一氧化氮（NO）代谢终产物——亚硝酸盐/硝酸盐（
）测定在哮喘临床中的应用价值。方法 应用Griess重氮法测定45例不同时期、不同程度哮喘患者及15例慢性支气管炎(慢支)合并肺心病急性发作期患者痰液、血清含量,同步测定哮喘患者痰液中嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）水平及肺通气功能。结果 哮喘轻、中、重度发作期患者痰液中位数浓度（分别为131 μmol/L、136 μmol/L）与缓解期组（85 μmol/L）及正常对照组（63 μmol/L）比较，差异有显著性（P＜0.05）；发作期组与缓解期组比较差异有显著性（P＜0.05）；慢支合并肺心病急性发作期患者痰液水平（33 μmol/L）与各哮喘组及正常对照组比较，差异有显著性（P＜0.05）。缓解期及发作期哮喘患者痰液与一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV1占预计值％）间呈显著负相关（r分别=-0.587、-0.485,P均＜0.05）；而痰液与ECP间呈显著的正相关（r分别=0.563,P＜0.05；0.535,P＜0.01）。15例中、重度哮喘患者治疗后,痰液水平与治疗前比较差异有显著性（P＜0.01）。结论 痰液可能成为监测哮喘气道炎症,评价药物疗效的指标。
The changes of level in sputum from patients with asthma and their clinical implications
WANG Yu, WANG Chen, TONG Zhaohui
Respiratory Disease Research Center, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital Affiliate of Capital University of Medical Sciences,Beijing 100020
【Abstract】 Objective To evaluate the clinical applications of the detection of the stable end products of NO, nitrite and nitrate () in sputum from patients with asthma. Methods 45 patients with asthma at remission (groupⅠ,n=15) or exacerbation state with mild attack (groupⅡ,n=15) or moderate to severe attack (groupⅢ,n=15) , 15 cases of chronic cor pulmonale secondary to chronic bronchitis at exacerbation (groupⅣ), and 20, normal control subjects (groupⅤn=20) were included in this study. in sputum and serum were measured by Griess reaction , while the eosinophil cationic protein (ECP) in sputum and pulmonary function were also measured in tested patients with asthma. Results The median concentrations of sputum in groupⅠ, Ⅱand Ⅲwere 85, 131 and 136 μmol/L respectively , all were significantly higher than that in controls (63 μmol/L); those of groupⅡ and Ⅲ were significantly higher than that of groupⅠ, while that of group Ⅳ (33 μmol/L) was significantly lower than those of the asthmatic groups and the control. The level of NO derivatives in sputum was closely correlated with the degree of airflow obstruction and sputum ECP levels in patients with asthma at remission (r=-0.587, P＜0.05; r=0.535, P＜0.01 respectively) and exacerbation (r=-0.485, P＜0.05; r=0.563, P＜0.05 respectively). There was no significant correlation between serum and sputum , and no significant correlation between serum and the degree of airflow obstruction. A significant decrease in the concentration of sputum was observed after therapeutic treatment of patients with moderate to severe attack (136 vs 93 μmol/L). Conclusion The level of in sputum may be a useful marker for monitoring the state of airway inflammation and assessing the therapeutic efficacy.
【Key words】 Asthma Sputum Nitric oxide Eosinophil cationic protein
支气管哮喘是一种慢性气道炎症疾病。一氧化氮（NO）作为一种与气道炎症相关的物质近年来受到普遍重视, 研究表明，气道内NO水平可作为反映哮喘气道炎症的指标之一。国外报道，痰液中NO代谢终产物可以间接反映气道内NO的变化［1］。我们的研究观察了不同时期、不同程度的哮喘患者痰液中的含量变化,及其与嗜酸细胞活化、气流阻塞程度之间的关系,并观察了15例中、重度哮喘患者治疗前后痰液的含量变化，比较哮喘患者与慢性支气管炎合并肺心病急性发作期患者痰、血水平的差异。旨在探讨痰液测定在哮喘临床中的应用,并比较痰液及血清在反映哮喘气道炎症方面的差异。
对象与方法
一、对象
1.哮喘组：根据中华医学会呼吸病学分会1997年哮喘防治会议制定的标准［2］，选择明确诊断为过敏性支气管哮喘的患者45例。排除其它心肺疾病，无寄生虫感染及其它过敏性疾病；受检前8小时内未用β2受体激动剂。根据病情分为以下三组：Ⅰ组：支气管哮喘缓解期患者15例，其中男7例，女8例，平均年龄42岁。该组中5例患者长期吸入丙酸倍氯米松气雾剂治疗，每日剂量200～300 μg，其余10例患者未行糖皮质激素吸入治疗。Ⅱ组：支气管哮喘轻度发作期患者15例，其中男8例，女7例，平均年龄45岁。该组患者全部接受二丙酸倍氯米松（400～800 μg/d）及沙丁胺醇气雾剂（400～600 μg/d）吸入治疗。Ⅲ组：支气管哮喘急性中、重度发作期患者15例，其中男8例，女7例，平均年龄47岁。该组患者根据病情接受口服泼尼松（10～20 mg/d）或静脉滴注糖皮质激素（琥珀酸氢化考的松400～800 mg/d）治疗，同时给予解痉、平喘等对症治疗；其中3例患者接受机械通气治疗。治疗前及治疗7～10天后临床达显效标准时分别测定各项指标，比较治疗前、后的变化。上述三组受试者均无吸烟史，近4周内无上呼吸道感染史。
2.慢性支气管炎合并肺心病急性发作期组（Ⅳ组）：根据1977年全国肺心病会议所订立的诊断标准，选择慢性支气管炎所致慢性肺心病急性发作期患者15例，其中男9例，女6例，平均年龄74岁，均有吸烟史（每年平均314支）。
3.正常对照组（Ⅴ组）：选择正常无吸烟史的健康成人20名，其中男7名，女8名，平均年龄45岁。根据病史及有关检查排除任何过敏性疾病、寄生虫感染及自身免疫性疾病；无心、肺、肝、肾等疾患,无服用硝酸酯类及激素类药物史，近4周内无上呼吸道感染史。上述各组间性别构成相匹配。
二、标本收集及处理
1.痰诱导及痰液收集：参照文献［3］报道方法以3.5%高渗盐水50 ml雾化吸入行痰诱导，诱导前吸入沙丁胺醇200 μg。诱导前、后及诱导过程中监测肺通气功能［一秒钟用力呼气容积（FEV1）及一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV1占预计值%）］。其中部分重度哮喘发作期患者采用经气管插管取痰(3例)或自发咳痰(4例FEV1占预计值%＜40%哮喘患者)的方法留取痰液标本。收集的痰液标本在1小时内处理，处理前保存于4℃冰箱。
2.痰液的处理：以4倍痰液体积的1%二硫苏糖醇(DTT)及Dubecco平衡盐溶液(DBS)对痰液进行处理。上清液分装于离心杯，置于－20℃保存，用以检测痰液中、嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)等。细胞沉淀层以DBS液重新制成细胞悬液，以进一步观察和评价痰液质量。
3.血清标本的收集：受试者在留痰的同时取空腹静脉血3 ml，分离血清-20℃保存，用以检测血清。
三、实验方法
1.痰液的质控：采用台盼蓝及苏木精-伊红染色法染色, 计算鳞状上皮细胞百分比及细胞活力。如果细胞活力＞50%，鳞状上皮细胞百分比＜20 % 或每高倍视野鳞状上皮细胞数＜3个，即认为痰液标本符合实验设计要求，进一步检测液相指标。
2.痰液及血清的测定：采用Griess重氮法（试剂盒由军事医学科学院提供）进行检测，具体操作参照药盒说明。检测灵敏度为2 μmol/L。
3.痰液ECP的测定：应用荧光酶标法测定（试剂盒由瑞典Kabi-Pharmacia公司提供）。检测灵敏度为2 μg/L。
4.肺通气功能测定方法:采用电脑化肺功能仪（vitrograph床旁便携式肺功能仪，英国）测定肺通气功能,记录FEV1及FEV1占预计值％。
四、统计方法
采用SPSS 6.0版软件进行处理。痰液、血清及痰液ECP检测数据不符合正态性分布, 采用中位数（四分位数间距）描述, 对数转换后进行统计分析；肺通气功能指标FEV1及FEV1占预计值％以均数±标准差描述。组间比较采用方差分析, 进一步以q检验进行两两比较。哮喘中、重度发作组治疗各指标及肺通气功能变化采用配对t检验。哮喘缓解期及发作期患者的各项指标与肺通气功能以及各指标之间关系的比较采用直线相关关系比较。
结果
一、痰液、血清中及痰液ECP的测定结果
哮喘发作期患者痰液及血清中水平显著高于缓解期及正常对照组（P＜0.05）、轻度发作组与中、重度发作组之间比较差异无显著性（P＞0.05）；缓解期哮喘患者痰液中水平显著高于正常对照组（P＜0.05）；但其间血清比较差异无显著性(P＞0.05)。慢性支气管炎合并肺心病急性发作期组患者痰液及血清中水平显著低于各哮喘组及正常对照组（P＜0.05）。
哮喘缓解期及发作期患者痰液中ECP水平显著高于正常对照组（P＜0.05）；发作期高于缓解期水平（P＜0.05）；轻度发作组ECP水平低于中、重度发作组，但经统计学分析差异无显著性（P＞0.05，表1）。
二、中、重度哮喘治疗前、后痰液及血清中、ECP及FEV1占预计值%变化的比较
中、重度哮喘组患者治疗后痰液及血清、痰液ECP浓度与治疗前比较差异有显著性（P＜0.05）；治疗后肺功能指标FEV1及FEV1占预计值％与治疗前比较差异有显著性（P＜0.01, 表2）。
三、哮喘缓解期、发作期各指标与肺通气功能以及各指标之间的相互关系
哮喘缓解期患者痰液中、ECP与FEV1占预计值％呈显著负相关，相关系数分别为（r＝-0.587, -0.580, P均＜0.05）。血清中与FEV1占预计值％之间呈负相关趋势，但尚无统计学意义（r＝-0.269, P＞0.05）。
哮喘发作期患者痰液中、ECP与FEV1占预计值％呈显著负相关，相关系数分别为（r＝-0.485, -0.390，P均＜0.05）。血清中与FEV1占预计值％之间呈负相关趋势，但尚无统计学意义（r＝-0.115, P＞0.05）。
哮喘发作期及缓解期患者痰液与血清中之间无显著相关；痰液中与ECP之间呈显著正相关（r值分别为0.535，P＜0.01；0.563，P＜0.05）。
讨论
哮喘是一种慢性气道炎症。如何以无创性方法监测哮喘气道炎症是目前研究的热点之一。近年来NO作为一种与哮喘气道炎症相关的物质而受到普遍重视,大量研究表明，哮喘时气道内源性NO的水平在一定程度上可以反映气道炎症程度［4-6］。痰诱导及痰液分析已广泛应用于哮喘气道炎症研究中, 具有无创性、样本易获得、结果可重复性强的特点,而且痰液是来源于外周气道至中央气道的分泌物,具有更为集中的细胞和生化物质成分,能够反映气道分泌物自然状态下的浓度, 同时在炎症病理状态下,气道内NO氧化速率很快,生成后迅速转变为稳定的代谢终产物；因而推测痰液中水平可能反映了某一时期气道局部NO的平均水平。
表1 各组痰液、血清及痰液ECP测定结果的比较
| 组别 |
例数 |
痰液▲
(μmol/L) |
血清▲
(μmol/L) |
痰液ECP▲
(μg/L) |
| 哮喘缓解期组 |
15 |
85(20) |
6(2.55) |
112( 322) |
| 哮喘轻度发作组 |
15 |
131(33)*△ |
8(1.13)*△ |
527(1689)*△ |
| 哮喘中、重度发作组 |
15 |
136(26)*△ |
9(3.96)△ |
963(1813)△ |
| 慢支合并肺心病急性发作期组 |
15 |
33(25)# |
5(1.42)# |
- |
| 正常对照组 |
20 |
63(27) |
6(1.84) |
25( 149) |
注：▲数据以中位数(四分位数间距)表示；与正常对照组比较P＜0.05；与哮喘缓解期组比较△P＜0.05；与各哮喘组及正常对照组比较#P＜0.05
表2 中、重度哮喘发作治疗前后痰液、血清及痰液ECP、FEV1占预计值%比较
| 组别 |
例数 |
痰液▲
(μmol/L) |
血清▲
(μmol/L) |
痰液ECP▲
(μg/L) |
FEV1(L)△ |
FEV1占预计值%△ |
| 治疗前 |
15 |
136(26) |
10(4.0) |
963(1813) |
1.04±0.33 |
41±12 |
| 治疗后 |
15 |
93(33) |
7(2.3) |
419(1022) |
1.79±0.36 |
73± 8 |
| P值 |
|
＜0.01 |
＜0.05 |
＜0.05 |
＜0.01 |
＜0.01 |
注：▲数据以中位数(四分位数间距)表示；△数据以均数±标准差表示
本组研究观察了哮喘不同时期以及不同程度发作时痰液中水平的变化，并比较了哮喘患者与慢性肺心病急性发作期患者痰液中水平的差异。结果提示，哮喘时痰液水平增高, 并与气道炎症状态相一致, 因此痰液中水平一定程度上可以反映哮喘气道炎症状态。缓解期哮喘患者痰液水平仍高于正常对照组, 与Kanazawa等［1］报道结果一致, 提示即使在无明显肺通气功能障碍的情况下，气道慢性炎症仍可能持续存在, 为哮喘缓解期继续抗炎治疗提供了依据。轻度发作组与中、重度发作组之间痰液水平差异尚无统计学意义, 可能与部分发作期患者在入院前即已接受糖皮质激素治疗有关。同时，我们还发现慢性支气管炎合并肺心病急性发作期患者痰液血清中水平显著低于各哮喘组及正常对照组，这与于文成等关于肺心病患者血浆内源性一氧化氮水平变化的研究相印证，推测可能与慢支所致慢性肺心病患者的长期吸烟史及慢性缺氧状态有关，慢性缺氧及吸烟可导致NO合成和释放减少，而NO合成与释放的减少又是导致和加重肺动脉高压的原因之一。对于肺心病缓解期及其与某些非过敏性哮喘患者痰液水平的变化有待进一步观察。
本组研究结果表明，无论是哮喘缓解期还是发作期,痰液水平与肺通气功能(FEV1占预计值%)以及痰液ECP之间均存在着显著的相关关系, 提示哮喘时痰液水平与气流阻塞程度及嗜酸细胞活化状态有关,进一步提示水平在一定程度上可反映哮喘气道炎症程度,可能成为监测哮喘气道炎症的指标。
传统监测哮喘治疗的手段主要是通气功能测定和病情变化记录。这些方法只能在一定程度上反映气道的功能状态。国内外文献报道，测定血清、痰液、支气管肺泡灌洗液中炎性指标可监测和指导哮喘治疗。本组研究中我们发现，15例中、重度哮喘患者治疗前痰液中水平显著高于缓解期和正常对照组, 经糖皮质激素等药物综合治疗后其水平明显降低, 但仍高于正常对照组,同时患者肺通气功能得到明显改善；提示痰液水平随气道炎症消长而变化, 因此痰液水平可作为判断哮喘临床疗效的指标，动态监测痰液的变化,寻求个体的变化规律和基础稳定水平可能会有助于哮喘临床治疗过程中药物的调整。
既往对哮喘时血清的变化报道不一［7］。从我们的研究结果可以看出，哮喘缓解期组与正常对照组之间血清水平尚未构成显著性差异,而痰液水平已构成了显著性差异。 同时,血清与FEV1预计值%之间无显著相关；与痰液水平之间亦无显著相关, 提示作为监测哮喘气道炎症的指标,痰液较血清更准确、更直接。这可能与血清水平可受外源性及其它非气道源性NO代谢产物的影响有关,而痰液中水平则反映了气道局部的NO水平。
总之哮喘时痰液中内源性NO代谢终产物水平显著增高与哮喘气道炎症状态相一致,并随气道炎症消长而变化,因此痰液中水平能够在一定程度上反映气道炎症状态；痰液中的动态变化可作为观察药物疗效的指标。与血清比较,痰液中水平能够更准确、直接地反映气道内源性NO水平及气道炎症状态。为进一步探讨内源性NO在哮喘发病中的作用及地位提供了有益的途径。
参考文献
1 Kanazawa H, Shoji S, Yamada M, et al. Increased levels of nitric oxide derivatives in induced sputum in patients with asthma. J Allergy Clin Immunol ,1997，99:624-629.
2 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案).中华结核和呼吸杂志,1997，20:261-267.
3 Wong HH, Fahy JV. Safty of one method of sputum induction in asthmatic subjects. Am J Respir Crit Care Med, 1997，156:299-303.
4 Masaro AF, Gaston B, Kita D, et al. Expired nitric oxide levels during treatment of acute asthma .Am J Respir Crit Care Med, 1995，152:800-803.
5 Kharitonov SA , Yates DH ,Robbins RA ,et al. Corticosteroids decrease exhaled nitric oxide .Am J Respir Crit Care Med ,1994，149:201.
6 向莉, 刘世英, 江载芳. 呼出气一氧化氮浓度监测儿童哮喘气道炎症的初步探讨.哮喘杂志,1997，3:7-11.
7 蒋东波,李华强,史源,等.支气管哮喘与一氧化氮及cGMP关系的初步研究.实用儿科临床杂志,1996，11:1-2.
收稿：1998-12-23
修回：1999-03-19
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