保肺冲剂治疗哮喘的实验研究
中草药 1999年第7期第30卷 药理实验与临床观察
作者：王淑芬 翁福海 林秀珍 张 骏
单位：王淑芬 天津干部疗养院内科 300191；翁福海 林秀珍 张 骏 天津医科大学药理教研室
关键词：保肺冲剂；迟发性超敏反应；血清溶血素；脾/胸腺指数；CD4细胞；CD8细胞
摘 要 探讨保肺冲剂(BC)治疗哮喘作用的机制。测定动物迟发性超敏反应；血清溶血素值、血液CD4/CD8细胞比值及对离体豚鼠肠管平滑肌抗乙酰胆碱、组织胺作用。结果表明BC使小鼠耳片重量明显减轻；使小鼠脾指数增加，胸腺指数降低；显著提高被环磷酰胺抑制的CD8细胞，使T淋巴细胞亚群CD4/CD8细胞比值增加及有拮抗乙酰胆碱、组织胺收缩离体豚鼠肠管平滑肌的作用。
保肺冲剂(简称BC)由川贝母、桑白皮、黄芩、生石膏等组成，用于治疗喘息性支气管炎或支气管哮喘，疗效显著。我们探讨了BC治疗哮喘作用的机制：1)对细胞免疫(迟发性超敏反应)影响；2)对免疫器官重量的影响；3)对体液免疫(血清溶血素产生)的影响；4)对外周血中T淋巴细胞亚群CD4，CD8细胞数及其比值的影响；5)拮抗乙酰胆碱、组织胺收缩豚鼠离体肠管平滑肌的作用。
1 材料
1.1 动物：昆明种小鼠，体重(23.81±2.07) g，大鼠体重(180±25) g，雌雄各半，豚鼠体重(300±45) g，雌雄各半。以上均由天津药物研究院动物室提供。
1.2 药品：保肺冲剂(BC)由天津肺科医院提供，94津卫药制剂(33)第73号；1%二硝基氯苯(1%DNCLB)，北京化工厂生产，批号：810928；碱性磷酸酶桥联酶标试剂盒(大鼠T细胞亚群检测试剂盒，APAAP Kit)，北京军事医学科学院生物制品发展中心提供，内含小鼠抗大鼠CD3分子与CD4分子的单抗(MaR-CD3，MaR-CD4)及酶联二抗等制剂。环磷酰胺Endoxan-Asta 200 mg，德国制品。大鼠淋巴细胞分离液，由中国医学科学院血液学研究院供应，体积质量比1.087±0.002。磷酸缓冲液(PBS)0.01 mol/L，pH 7.2(Na2HPO4 153.30 g，NaH2PO4*H2O 57.96 g，NaCl 1227.24 g，加双蒸水至15 L。二盐酸组织胺(生化试剂，由中国科学院上海生物化学研究所)；氯化乙酰胆碱(生化试剂，北京东环联合化工厂)；Tyrosine(台氏液，每升含NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g， CaCl2 0.2 g，MgCl2 0.1 g，NaH2PO4 0.05 g，NaHCO3 1 g，葡萄糖10 g)。
1.3 仪器：722型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂生产，LB801型超级恒温器；LMS-2A型二道生理双笔记录仪；离体组织水浴槽。
2 方法和结果
2.1 对小鼠迟发型变态反应的影响：将小鼠随机分为7组，即对照组，等容量生理盐水0.4 mL/10 g，环磷酰胺(CY)组［16 mg/(kg*d) ip 每隔日1次，共5次］，BC大、中、小剂量组(14.56、2.91、1.46 g/kg)。每组均按0.4 mL/10 g体重ig，连续给药10 d。给药第6天除盐水组外，以1%DNCLB(250 μL)涂于小鼠腹部(去毛)3 cm×3 cm面积致敏，致敏后第5天涂右耳攻击，左耳为对照，24 h后脱臼处死，同时用直径8 mm打孔器取两耳片称重，以两耳片称重之差值进行统计学处理，结果见表1。
表1 对小鼠迟发型超敏反应的影响(
±s)
|
组 别 |
鼠数 |
耳片重量差(mg) |
| 对照组 |
11 |
4.625±2.13△△ |
| CY组 |
12 |
1.75±0.89** |
| BC大剂量 |
8 |
2.875±1.13△ |
| BC中剂量 |
10 |
2.167±0.75* |
| BC小剂量 |
10 |
1.89±0.78** |
| 与CY组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01
与对照组比较：P＜0.05 **P＜0.01(下同) 结果表明各剂量组BC均使小鼠耳片重量明显减小，与正常对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，与CY组相似，表明该药对细胞免疫(迟发型超敏反应)有明显抑制作用。
2.2 对小鼠免疫器官胸腺及脾脏指数的影响：取2.1小鼠处死后摘除胸腺及脾脏称湿重并计算胸腺及脾指数(每10 g小鼠体重含有的胸腺或脾mg重量，mg/10 g)，结果见表2。
表2 对小鼠免疫器官重量的影响(±s) |
| 组别 |
鼠数 |
脾重量(mg) |
脾指数 |
胸腺重量(mg) |
胸腺指数 |
| 组别 |
11 |
113.27±20.20 |
47.91±12.94△△ |
74.55±21.49 |
28.14±8.30 |
| CY |
10 |
104.10±49.75 |
36.69±15.94 |
18.20±6.25** |
6.40±2.38** |
| BC大剂量 |
8 |
144.60±43.72* |
57.21±11.97 |
48.80±16.91**△△ |
19.22±6.63*△ |
| BC中剂量 |
10 |
144.70±46.99 |
64.18±24.18 |
46.70±21.47*△△ |
20.56±10.30 |
| BC小剂量 |
10 |
162.87±35.56** |
68.6±13.91**△△ |
48.38±14.80*△△ |
20.15±5.52*△△ |
| 结果表明BC各剂量组均使小鼠脾脏重量及脾脏指数明显增加，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，与CY组抑制作用比较有极显著性差别(P＜0.01)。各剂量组均使小鼠胸腺重量明显减低，与对照组比较有显著性差异；其抑制作用小于CY组。
2.3 对小鼠血清溶血素产生的影响：分组及给药方法同2.1，于给药后第10天用60% SRBC 0.2 mL/只ip免疫，5 d后取血，并作补体结合实验，用722型分光光度计测定血清溶血素半数溶血素值(HC50)，并进行组间t检验，结果见表3。
表3 对小鼠血清溶血素的影响(±s) |
|
组 别 |
鼠 数 |
HC50 |
| 对照组 |
11 |
9.77±0.40 |
| CY组 |
10 |
3.91±1.40** |
| BC大剂量 |
10 |
27.93±14.28** |
| BC中剂量 |
10 |
31.96±17.47** |
| BC小剂量 |
8 |
21.61±7.10** |
结果表明 各剂量组的BC测定的小鼠血清HC50明显大于对照组或CY组，表明该药有增强体液免疫作用；CY组显著抑制体液免疫作用，HC50明显减少。
2.4 对大鼠外周血中T淋巴细胞亚群的影响：将SD大鼠随机分为4组，即对照组(NS组)0.4 mL/100g,ig，每日1次，共10 d；BC组14.6g/kg(0.4 mL/100g)ig,每日1次，共10d，CY组16 mg/kg·d，ip，隔日1次，共5次，BC+CY组(中药小剂量及CY用量同上)。应用碱性磷酸酶桥联免疫组化法(APAAP)测试方法如下：(1)单个核细胞涂片制备方法：大鼠眼内取血3 mL置于肝素管内，以PBS稀释3倍，重层于含有3mg淋巴细胞分离试管内，离心，吸取血浆和分离液之间的单个核细胞层，加PBS液洗涤，离心，去掉上清液，沉淀即为单个核细胞。用手推片法制备细胞图片标本。(2)标本染色：细胞图片标本干燥后用丙酮固定3 min后用PBS液洗3次，依次加抗大鼠T细胞亚群单克隆抗体MaR-CD3或MaR-CD4单克隆后加羊抗鼠IgG二抗，加APAAP复合物，加碱性磷酸底物显色。以上每步骤均用0.01 mol/L pH 7.2 PBS液洗3次，最后加苏木素复染。(3)高倍镜下观察，细胞核呈兰色，细胞表面有红色标志物的细胞为阳性细胞，无红色标记物的细胞为阴性细胞。计数200个单个核细胞，计算阳性细胞百分率(%)，结果用t检验作统计学处理，见表4。
表4 对大鼠外周血中T淋巴细胞亚群的影响(±s)
| 组别 |
鼠数 |
CD4细胞(%) |
CD8细胞(%) |
CD4/CD8 |
| 对照组 |
6 |
51.16±5.98 |
23±6.03 |
2.31±0.45 |
| BC组 |
7 |
57.29±23.07 |
38.57±18.83△ |
1.85±0.90 |
| CY组 |
7 |
64.29±16.37 |
62.57±13.76** |
1.06±0.34** |
| CY+BC组 |
6 |
50.68±15.83 |
24±4.15△△ |
2.15±0.09△△ |
结果表明CY组CD8细胞数明显增加，大于盐水对照组及BC组；加入BC后CD8细胞数明显减小，CD4/CD8的比值增加。
2.5 抗过敏介质及抗乙酰胆碱作用：按文献制备豚鼠离体回肠实验标本［1］。取豚鼠离体回肠段置离体组织水浴槽液中稳定30 min后(回肠自然收缩蠕动消失)，描记基线。1)在充满台氏液的浴槽中加入生理盐水，描记收缩活动，观察15 min未见明显收缩；2)将水浴中液体排出换取新液依次分别加入组织胺液和乙酰胆碱液(在浴槽中终浓度均为2×10-7g/mL，可见肠管立即收缩，观察描记15 min，待肠管的收缩反应恢复到基线水平时再加入相同量的组织胺液或乙酰胆碱液以及BC原液(终浓度为6×10-2g/mL)，记录描记肠管的收缩幅度。以t检验比较加入BC前后组织胺组和乙酰胆碱组肠管的收缩幅度，并与生理盐水对照组进行比较，结果见表5。
表5 抗组织胺及抗乙酰胆碱对豚鼠离体回肠的收缩作用(±s)
| 组别 |
例数 |
加BC前(mm) |
加BC后(mm) |
| 对照组 |
8 |
0.24±0.33 |
0.26±0.23 |
| 组织胺组 |
8 |
5.59±1.79** |
0.34±0.32△△ |
| 乙酰胆碱组 |
8 |
7.69±4.72** |
1.06±2.00** |
与对照组比较：**P＜0.01
与加中药前比较：△△P＜0.01 结果表明豚鼠离体回肠在加入BC前对组织胺及乙酰胆碱的收缩幅度显著大于对照组；加入BC后收缩幅度显著性减小，显示BC有拮抗组织胺及乙酰胆碱收缩豚鼠离体回肠作用。
3 讨论
胸腺是T淋巴细胞分化成熟的免疫器官，含有大量的T细胞，它释放多种细胞因子，参与调节细胞免疫及体液免疫作用［2，3］。BC使小鼠耳片重量减轻(迟发型超敏反应，DTH)，使小鼠胸腺重量显著减轻，表明对细胞免疫有抑制作用。BC明显升高小鼠溶血素值(HC50)，与正常对照组比较有显著性差别(P＜0.05)，与CY抑制作用比较有极显著性差别(P＜0.01)。脾脏含有大量B细胞和浆细胞，是体内产生抗体的重要器官，BC使小鼠脾重量及脾指数明显增加，表明它有增强体液免疫作用［4］。BC明显提高CD4及CD8细胞比值，尤其对CY作用后处于免疫抑制状态的大鼠，能使其比值恢复到正常，表明该药可能具有调节T淋巴细胞亚群的作用。T淋巴细胞亚群主要包括CD4细胞(辅助性/诱导性T细胞，Th)及CD8细胞(抑制性/细胞毒性T细胞，Ts)，CD4细胞促进B细胞增殖和分化，CD8细胞则抑制之，使抗体IgE的合成减少。CD4细胞与CD8细胞比势调节保持体内细胞免疫及体液免疫动态平衡，当CD4细胞显著减少或CD8细胞异常增高时，导致CD4/CD8比值减少或倒置，它使自身抗体增多，诱发自身免疫性疾病或免疫病理反应，诱发或加重哮喘发病进程。据文献报道［5］，当CD4/CD8比值超过2.0时，机体免疫应答能力增强，当CD4/CD8比值小于1.0时，机体免疫功能减弱。临床观察保肺冲剂可使哮喘病人血中CD4细胞增加或CD8细胞数量减小，使两者比值恢复正常，本实验结果与之相符。组织胺为速发型变态反应过程中由肥大细胞、嗜碱性粒细胞、肺组织等释放的过敏性介质，在哮喘病人支气管肺泡灌洗液中可检出大量上述炎性细胞以及它们释放的炎性介质［6］，它同乙酰胆碱一样均具有强大的收缩支气管平滑肌作用。本实验结果表明，BC明显抑制组织胺及乙酰胆碱对豚鼠离体回肠的收缩作用。总之，保肺冲剂抗喘作用机制可能与抑制细胞免疫，增强体液免疫作用有关；与调节T淋巴细胞亚群细胞间的相互作用有关，以及与拮抗组织胺及乙酰胆碱收缩平滑肌的作用有关［7，8］。
参考文献
1 徐淑云，等.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991：1201
2 Bloom B R,et al. Immunol Today, 1992，13(4)：131
3 吴昌归，等.上海免疫学杂志，1997，17(1)：34
4 Liu M C, et al. Am Rew Respir Dis. 1991, 144:51
5 Zhang Xiu-zhen, et al. CJIM, 1995, 1(3):171
6 潘 泽，等.国外医学-内科学分册，1999，26(3)：111
7 吴敏毓，等.医学免疫学.合肥：中国科学技术大学出版社，1993：96
8 平奎云，等.中国免疫学杂志，1997，13(1)：61
收稿日期：1999-03-02
