慢性胃炎及消化性溃疡诱生型一氧化氮合酶表达和Hp感染的意义

世界华人消化杂志 1998年第7期第6卷 研究原著

作者：王德荣¹　陈　健²　李君曼²　张振国³

单位：1山东省济南市中心医院消化内科　250013；山东医科大学　2附属医院消化内科　3病理教研室　250012

关键词：胃炎/微生物学；消化性溃疡/微生物学；螺杆菌感染；氨基酸氧化还原酶类/代谢

　　expression of inducible nitric oxide synthase and Hp infection in chronic gastritis and peptic ulcer

　　WANG De-Rong1, CHEN Jian2, LI Jun-Man2 and ZHANG Zhen-Guo3

　　1Department of Gastroenterology, Jinan Central Hospital, Jinan 250013, 2Department of gastroenterology, The Affiliated Hospital, and 3Department of Pathology, Shandong Medical University, Jinan 250012, Shandong Province, China

　　Subject headings　gastritis/microbiology; peptic ulcer/microbiology; Helicobacter infections; amino acid oxidoreductases/metablism

　　Abstract

　　AIM　To observe the effect of iNOS in chronic gastritis and peptic ulcer in and to identify the relationship between iNOS expression intensity and Hp inflection.

　　METHODS　iNOS expression intensity in tissues of 56 patients with chronic gastritis, 16 patients with peptic ulcer and 6 normal controls was examined by immunohistochemical staining. Hp grades were determined synchronously by modified Giemsa stain.

　　RESULTS　Gastric and duodenal epithelial cells and crypts showed noticeable positive staining in normal controls. Overexpression was observed in patients with chronic superficial gastritis, its mean expression levels were significantly higher than those in controls and in chronic atrophic gastritis (P＜0.01). The mean expression levels in patients with chronic atrophic gastritis showed no significant differences compared with controls. There was a significant positive correlation between iNOS expression intensity and Hp grades in patients with chronic gastritis (P＜0.05). The mean expression levels in patients with peptic ulcer were significantly higher than those in normal controls (P＜0.05).

　　CONCLUSION　Enhanced iNOS activity in gastric and duodenal mucosa may contribute to the pathogenesis of chronic gastritis and peptic ulcer. Inducible generation of NO by inflamed gastric mucosa may be one of the mechanisms to explain the link between Hp infection and chronic gastritis.

　　中国图书资料分类号　R574.1　R573.3

　　摘　要

　　目的　探讨一氧化氮在慢性胃炎及消化性溃疡发病机制中的作用，以及NO和Hp感染的关系.

　　方法　用免疫组化法对正常对照者6例，慢性胃炎56例及消化性溃疡患者16例的胃粘膜标本进行检测，观察iNOS表达强度. 并用改良Giemsa法同步检测Hp感染状况.

　　结果　iNOS染色定位于胞质，在正常人胃及十二指肠粘膜细胞和腺体均有表达. 慢性浅表性胃炎组呈过度表达，其平均表达强度明显高于对照组及慢性萎缩性胃炎组(P＜0.01). 慢性萎缩性胃炎组平均表达水平和对照组比较差异无显著性(P＞0.05). 慢性胃炎组iNOS表达强度与其Hp分级间呈明显正相关(P＜0.05). 消化性溃疡组平均表达水平较对照组增强(P＜0.05)，其iNOS表达强度和Hp分级间相关性不明显(P＞0.05).

　　结论　iNOS活性增强和过度表达可能在慢性胃炎和消化性溃疡的发病机制中发挥一定作用，并可能是Hp感染导致慢性胃炎的相关发病机制之一.

　　0　引言

　　一氧化氮(NO)和消化系统的生理功能及临床病理之间存在着广泛而密切的联系. NO是左旋精氨酸在NO合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化作用下生成的，NOS分为两型：原生型(cNOS)和诱生型(iNOS). 迄今NO和消化道疾病的相关性研究仅限于实验动物模型及人类炎症性肠病等少数疾病. 我们旨在用免疫组化法观察iNOS在正常人及慢性胃炎、消化性溃疡患者中的表达以及iNOS表达强度和Hp感染分级的相关性，并探讨NO在上述疾病发病机制中的作用及临床意义.

　　1　对象和方法

　　1.1　对象　我院1996年内镜活检及手术标本共78例. 其中正常对照6例，为随机收集的经内镜检查大致正常的受检者. 慢性胃炎56例，男35例，女21例，年龄25岁～68岁，平均42.5岁. 除外自身免疫性胃炎及胆汁反流性胃炎. 消化性溃疡16例，男10例，女6例，年龄23岁～65岁，平均45岁. 标本均在胃窦部及十二指肠球部取材，取标本前1mo内患者未服用抗生素及糖皮质激素.

　　1.2　方法　兔抗人iNOS多克隆抗体(SC-649)由美国Santa Cruz公司生产，与cNOS无交叉反应. 即用型SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程公司. 标本均经福尔马林固定，常规石蜡包埋，制备4μm厚连续切片. 按SABC免疫组化操作常规进行，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片. 用改良Giemsa法检测Hp，并用半定量法［1］进行定量分析.

　　统计学处理　用χ2检验及四格表确切概率法.

　　结果判定　细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性. 结果判定综合染色强度及阳性细胞数两方面进行半定量分析，分别评为0～3分. 染色强度判定：阴性(0分)；染色弱但明显强于阴性对照(1分)；染色清晰(2分)；染色强(3分). 阳性细胞数判定：≤10%(0分)；11%～25%(1分)；26%～50%(2分)；≥50%(3分). 根据两项指标的积分数分为四级：0～1分为“-”；2分为“+”；3～4分为“++”；5～6分为“+++”.

　　2　结果

　　2.1　iNOS　①正常胃及十二指肠粘膜细胞和腺体免疫组织化学染色均呈阳性着色，显色较弱，呈弥漫性分布. 粘膜层巨噬细胞、中性粒细胞以及平滑肌细胞亦呈阳性着色. ②慢性浅表性胃炎组呈过度表达，其iNOS平均表达水平明显高于正常对照组及慢性萎缩性胃炎组(P＜0.01，表1). 慢性萎缩性胃炎组iNOS平均表达水平和对照组比较差异无显著性(P＞0.05，表1). ③消化性溃疡组iNOS平均表达水平较对照组增强(P＜0.05，表1).

　　表1　慢性胃炎及消化性溃疡胃粘膜中iNOS表达

　　aP＜0.05，bP＜0.01，vs 正常对照；dP＜0.01，vs 慢性浅表性胃炎组.

　　2.2　Hp感染　组织切片上Hp位于胃粘膜上皮表面的粘液及胃小凹中. 正常对照组的Hp检出率为16.7%. 慢性胃炎及消化性溃疡组的Hp检出率分别是51.8%和62.5%，均高于对照组(P＜0.05). 慢性胃炎组iNOS表达强度和Hp分级间呈明显正相关(P＜0.05，表2)，Hp分级越高，细菌量越多，iNOS表达越强. 消化性溃疡组iNOS表达强度和Hp分级间无明显相关性(P＞0.05，表3).

　　表2　慢性胃炎胃粘膜iNOS表达强度和Hp分级的关系

　　0.01＜P＜0.05，χ2=12.79.

　　表3　消化性溃疡胃粘膜iNOS表达强度和Hp分级的关系

　　p＞0.05，χ2=5.23.

　　3　讨论

　　iNOS又称巨噬细胞型，必须形成二聚体才具有生物活性，其催化NO合成的反应不依赖钙离子和钙调蛋白. 其主要特征是NO的释放量大，作用持续时间长. 产生的高水平NO是巨噬细胞杀伤病原微生物和肿瘤细胞的主要活性物质［2］. NO释放的同时伴有超氧阴离子产生，超氧阴离子与NO共同作用导致组织细胞氧化损伤和坏死. 最初人们认为iNOS主要存在于巨噬细胞和由巨噬细胞转变的细胞，现已证明iNOS广泛存在于人和哺乳类动物的多种细胞中，包括多种肿瘤细胞，如肝癌、腺癌、腹膜癌、黑素瘤等细胞. 机体内NO既具有保护功能又具有细胞杀伤和促炎的双重性. 国外学者研究动物炎症损伤模型发现，炎症初期，NO主要起抗炎保护作用. 随着炎症的持续和发展，大量的NO释放到组织，此时NO主要发挥组织损伤作用.

　　我们应用兔抗人iNOS多克隆抗体进行免疫组化染色，结果显示iNOS在正常胃及十二指肠粘膜细胞和腺体均有表达，这与国外多数报道一致［3-5］. 而Singer et al［6］研究发现肠粘膜及腺体细胞未见iNOS表达，这可能与检测方法及阳性标准不一等因素有关. 一般认为，正常人胃肠粘膜层既有cNOS又有iNOS存在，但肌层以cNOS为主. 本实验中慢性浅表性胃炎组呈过度表达，其iNOS平均表达水平无论是和正常对照组还是慢性萎缩性胃炎组比较，均有显著性差异. 研究表明，炎症病灶中有许多被激活的巨噬细胞和中性粒细胞积聚，细菌内、外毒素和某些细胞因子如TNF，IFNγ，IL1和IL2等均可诱导上述细胞产生iNOS，iNOS活性增强可以产生大量NO和超氧化物，后者可再生成过氧化亚硝酸盐导致组织损伤. 值得注意的是中性粒细胞和单核细胞在外周血中只具有cNOS而没有iNOS或含量很少［7］. 本实验中，炎性病灶区的胃肠粘膜及腺体细胞iNOS表达强度较对照组明显增强，表明炎症反应的某些递质对上述细胞中的iNOS产生诱导作用. Tepperman et al［8］发现内毒素和某些细胞因子可以诱导肠粘膜细胞iNOS的活性和表达. Miller et al［5］用回肠炎的动物模型进行的实验研究及Singer et al［6］用炎症性肠病患者的病理标本进行的免疫组化研究均证实了上述观点. Mourelle et al［4］证实内毒素可以诱导人结肠平滑肌中iNOS活性，中毒性巨结肠的发生与结肠平滑肌肌层中iNOS的诱导及过度表达产生大量NO有关. Reynold et al［9］观察到活动期溃疡性结肠炎患者结肠粘膜iNOS活性明显增强，NO产生明显增多. boughton-Smith et al［10］的研究表明，溃疡性结肠炎患者结肠粘膜层iNOS活性增加与其炎症程度呈正相关. 本实验中慢性胃炎与NO关系的研究结果与上述结论相似. 慢性萎缩性胃炎由于胃粘膜萎缩，腺体减少或消失以及炎性细胞转变为淋巴细胞和浆细胞，导致iNOS表达强度减弱，和慢性浅表性胃炎相比有显著性差异. 消化性溃疡患者溃疡底及边缘各层组织中均有iNOS表达，其iNOS平均表达强度较对照组增强.

　　近年来大量的临床及流行病学研究证实，Hp和慢性胃炎及消化性溃疡的发生和发展密切相关. 本项研究用改良Giemsa染色法检测Hp，慢性胃炎及消化性溃疡组的Hp检出率分别为51.8%和62.5%. Hp阳性率与文献报道相近. 本研究表明，慢性胃炎患者iNOS表达强度与Hp分级呈明显正相关，Hp分级越高，细菌量越多，iNOS表达越强. Hp感染胃粘膜最特征性的病理变化是慢性炎症伴表面上皮、胃小凹及固有膜内大量的单核细胞、多形核粒细胞浸润. Hp克隆性生长越严重，菌量越多，浸润的炎性细胞也越多［11］. 从而导致胃粘膜层iNOS被诱导使之活性明显增强，产生大量NO而发挥杀灭Hp及促炎造成炎症损伤的双重作用. 消化性溃疡组iNOS表达强度与其Hp分级之间相关性不明显，本组样本量较小，对实验结果可能有一定影响.

　　本文初步研究了iNOS在正常人及慢性胃炎、消化性溃疡患者组织中的表达，并探讨了iNOS表达和Hp感染状况的关系. 结果表明iNOS活性增强和过度表达可能在慢性胃炎和消化性溃疡的发病机制中发挥一定作用，并可能是Hp感染导致慢性胃炎的相关发病机制之一. 综上所述，慢性胃炎以及任何组织的慢性炎症都与iNOS活性增强产生大量NO及过氧化物有关. 随着对NO在炎症反应中作用研究的逐步深入，为我们治疗这类疾病开辟了新的途径. iNOS抑制剂的应用将为慢性炎症性疾病的临床治疗开辟新的途径.

　　4　参考文献

　　1　周殿元，杨海涛，张万岱主编. 幽门螺杆菌与胃十二指肠疾病. 第1版. 上海：上海科学技术文献出版社，1992：467-468

　　2　Stark ME, Szurszewski JH. Roles of nitric oxide in gastrointestinal and hepatic function and diseases. Gastroenterology, 1992;103(6):1928-1949

　　3 Rachmilewitz D, Karmeli F, Eliakim R, Stalnikowicz R, Ackerman Z, Amir G et al. Enhanced gastric nitric oxide synthase activity in duodenal ulcer patients. Gut, 1994;35(10):1394-1397

　　4 Mourelle M, Casellas F, Guarner F, Salas A, Riveros-Moreno V, Moncada S et al. Induction of nitric oxide synthase in colonic smooth muscle from patients with toxic megacolon. Gastroenterology, 1995;109(5):1497-1502

　　5 Miller MJS, Thompson JH, Zhang XJ, Sadowska-krowicka H, Kakkis JL. Roles of inducible nitric oxide synthase expression and peroxynitrite formation in Guinea pig ileitis. gastroenterology, 1995;109(5):1475-1483

　　6 Singer II, Kawka DW, Scott S, Weidner JR, Mumford RA, Riehl TE et al. Expression of inducible nitric oxide synthase and nitrotyrosine in colonic epithelium in inflammatory bowel disease. Gastroenterology, 1996;111(4):871-885

　　7 Yan L, Vandivier W, Suffrindini AF, Danner RL. Human polymorphonuclear leukocytes lack detectable nitric oxide synthase activity. J Immunol, 1994;153(4):1825-1834

　　8 Tepperman BL, Brown JF, Whittle BJR. Nitric oxide synthase induction and intestinal epithelial cell viability in rats. Am J Physiol, 1993;265(2):G214-G218

　　9 Reynold PD, Middleton SJ, Chan K. NADPH diaporase activity in ulcerative colitis. Gut, 1994;35(Suppl 4):A30-A31

　　10 Boughton-Smith NK, Evans SM, Hawkey CJ, Cole AT, Balsitis M, Whittle BJR et al. Nitric oxide synthase activity in ulcerative colitis and Crohn's disease. Lancet, 1993;342(8):338-340

　　11 Kazi JI, Sinniah R, Jaffrey NA, Alam SM, Zaman V. Cellular and humoral immune responses in Campylobactor-associated chronic gastritis. J Pathol, 1989;159(3):231-237

　　王德荣，男，1963-09-10生，山东济南市人，汉族. 1986年泰山医学院本科毕业，消化内科硕士研究生毕业，主治医师，主要从事消化系统疾病的诊治研究，发表论文8篇.

　　通讯作者　王德荣，250013，山东省济南市中心医院消化内科，山东省济南市解放路105号.

　　Correspondence to:WANG De-Rong, Department of Gastroenterology, Jinan Central Hospital, 105 Jiefanglu, Jinan 250013, Shandong Province, China

　　收稿日期　1997-11-10