中国人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的基因克隆及序列分析

免疫学杂志 2000年第5期第16卷 基础免疫学

作者：吴超　邹全明　张卫军　郭学青

单位：吴超（第三军医大学临床微生物学教研室，重庆 400038）；邹全明（第三军医大学临床微生物学教研室，重庆 400038）；张卫军（第三军医大学临床微生物学教研室，重庆 400038）；郭学青（第三军医大学临床微生物学教研室，重庆 400038）

关键词：幽门螺杆菌；尿素酶B亚单位；基因克隆；序列分析

　　［摘 要］ 目的 克隆人幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）尿素酶B基因（ureB），并分析其核苷酸序列的特性。方法 用PCR技术从临床分离的Hp菌株基因组中扩增出ureB基因，将其克隆至pHP质粒上进行序列分析。结果 克隆得到的ureB基因长度为1713bp，其核苷酸序列与GenBank公布的序列有61个碱基存在差异，同源为96.44％，推定的氨基酸序列同源性为99.65％。结论 我们所克隆的ureB基因可用于Hp保护性抗原UreB蛋白的表达并保持原有的免疫原性。

　　［中图分类号］ R37；Q78 ［文献标识码］ A

　　［文章编号］1000-8861（2000）05-0328-03

Cloning and characterization of ureB gene sequences of clinical isolated Hp strain in China

WU Chao， ZOU Quan-ming， ZHANG Wei-jun， GUO Xue-qing

　　（Department of clinical Microbiology，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

　　［Abstract］ Objective To investigate the sequence characterization of Helicobacter pylori ureB gene．Methods The gene encoding the structural B subunit of H pylori urease was amplified from the chromosomal DNA of clinical isolated H pylori strain by PCR．The gene was cloned in the plasmid pHP，and then was sequenced．Results The ureB gene was composed of 1713 base pairs，its nucleotide homology was 96．44％ as compared to the nucleotide reported in GenBank and encoded amino acids homology was 99．65％．Conclusion It was suggested that the cloned ureB gene could be used to expressed UreB recombinant protein and the protein can preserve its original immunogenicity．

　　［Key words］ helicobacter pylori；urease B subunit；gene cloning；sequence analysis

　　人幽门螺杆菌（helicobacter　pylori，Hp）为上消化道疾病的重要致病菌，可引起多种胃十二指肠疾病，包括B型（胃窦）胃炎，消化性溃疡，胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤和胃癌，而临床药物治疗常不能彻底、有效地杀灭Hp，导致耐药菌株的产生，给临床治疗带来严峻的挑战。因此，Hp疫苗的研制成为预防和治疗Hp感染的当务之急^［1］。Hp有着许多保护性抗原成分，如尿素酶、热休克蛋白、细胞空泡毒素等，其中尿素酶是一种免疫原性最为保守的蛋白质，它由A、B两个亚单位组成，呈六聚体，Mr分别为30 000和64 000左右，比例为1∶1，以B亚单位的免疫反应性最强^［2］。为了得到重组的尿素酶B亚单位（recombinant　urease　B，rUreB）蛋白，我们首先对幽门螺杆菌尿素酶B亚单位进行克隆，并分析其序列，为有效表达rUreB以及免疫原性研究奠定基础。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　菌株幽门螺杆菌由本室从临床患者中分离鉴定并保存。菌株E．coli　DH5a（supE44△lacU　169（Φ80lacZΔM15）hsdR17　recAl　endAl　gyrA96　thil　relAl）本室保存。pHP质粒为本室构建。Taq DNA聚合酶，限制性内切酶，T4 DNA连接酶等均为华美公司产品。

　　1.2　方法

　　1.2.1　Hp基因组DNA的提取：按参考文献［3］中的方法操作。

　　1.2.2　ureB　DNA的扩增：取Hp基因组DNA 5 μ1作为模板，按常规PCR法进行扩增，94 °C预变性5 min，加入4U的Taq　DNA聚合酶，按如下参数循环35次：94 °C变性1 min，55 °C退火2 min，72 °C延伸2 min，最后一个循环结束后72 °C反应5 min。

　　1.2.3　重组克隆及DNA序列分析：质粒抽提，酶切反应，DNA片段回收，电泳鉴定，连接反应，细菌转化及重组子筛选均按参考文献［4］中方法操作。DNA测序由上海皓嘉公司利用全自动DNA测序仪进行。

　　2　结果

　　2.1　幽门螺杆菌ureB目的基因的获得　根据GenBank公布的Hp　ureB　DNA序列^［5］，经微机分析设计两条引物：

　　primer　Ⅰ：5’-CGTCGATATCATGAAAAAGATTAGCAG-3’

　　primer　Ⅱ：5’-CGTCGATATCATCCTAGAAAATGCTAA-3’

　　引物Ⅰ为ureB蛋白N端的编码序列，引入起始密码子ATG及EcoR V酶切位点，引物Ⅱ为ureB蛋白C端编码序列的互补序列，引入EcoR V酶切位点。以Hp基因组DNA作为模板，经PCR扩增得到1　713　bp的全长ureB基因（见图1）。

图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

　　Fig　1Agarose gel electrophoresis of the PCR product

　　The λ DNA／HindⅢ markerC is shown in lane 1．

　　The PCR product obtained from the chromosomal DNA of Hp is shown in lane 2．

　　2.2　ureB基因的克隆及重组子的筛选与鉴定　将PCR扩增产物进行低熔点琼脂糖凝胶法回收纯化目的基因，EcoR V分别酶切ureB目的基因和质粒pHP，并对EcoR V酶切后质粒pHP进行去磷酸化。在T₄DNA连接酶作用下，ureB DNA和pHP质粒载体于16～18 °C连接过夜，然后转化E．coli　DH5　a，挑取可疑菌落抽提质粒进行筛选，对于滞后的重组质粒用EcoR V和BamHⅠ酶切鉴定。EcoRV酶切出1.7　kb和3．2　kb两片段的为可疑重组子，其中包括正向和反向克隆的重组子（见图2）。

图2重组质粒的EcoR V酶切鉴定

　　Fig　2Identification　of　recombinant　plasmids　digested　by　EcoR　V

　　1：pHP　Plasmid　digested　by　EcoR V；2：PCR　product；3，4，5，6：negative　recombinant　plasmid　digested　by　EcoR V；7：positive　recombinant　plasmid　digested　by　EcoRV；8：λ　DNA／HindⅢ　marker

　　由于ureB基因中存在BamHⅠ酶切位点，同时载体本身多克隆位点中亦带有BamHⅠ酶切位点，因此在BamHⅠ酶切后，出现1.0 kb片段和5．9 kb两片段的为正向克隆重组子，即目的重组质粒，而出现0.7 kb和4．2 kb两个片段的为反向克隆重组子（见图3）。

图3重组质粒的BamHⅠ酶切鉴定

　　Fig　3Identification　of　recombinant　plasmids　digested　by　BamHⅠ

　　1：pHP　plasmid　digested　by　BamHⅠ；2：λ　DNA／HindⅢ　marker；3，4，5，6：negative　recombinant　plasmid　digested　by　BamHⅠ；7：positive　recombinant　plasmid　digested　by　BamHⅠ；8：PCR　marker

　　2.3　ureB基因的序列测定及同源性分析　采用载体pHP上的特殊引物对ureB基因进行正反双向测序（见图4）。在1 713 bp核苷酸序列中，有61个碱基与文献［5］中报道的核苷酸序列不同，同源性为96.44％，由于氨基酸简并性的存在，仅有2个氨基酸与报道的氨基酸序列不同，分别为Ala-200变为Thr-200和Met-353变为Val-353，其同源性高达99.65％。

图4Hp　UreB基因的核苷酸序列及推定的氨基酸序列

　　Fig 4The nucleotide sequence of Hp UreB gene and predicted amino acide were shadowed．The stop codon was marked with asterisk．

　　3　讨论

　　Hp是一种基因变异性极大的细菌，它通过点突变、等位基因交换、基因重排及序列插入等使基因呈现出多样性^［6］，基因多样性是Hp的一个基本特点。尿素酶基因亦呈现出同样的特点^［7］。FOXALL等应用PCR方法扩增Hp　2．4　kb的ureA和ureB片段，其产物用HaeⅢ酶切，22株出现了10种酶切图谱^［8］．OWEN等同样以ureAB为靶基因，对来自10个国家383株Hp进行PCR-RFLP（HaeⅢ）分析出现82种图谱，更具代表性^［9］。我们克隆的Hp的1　713　bp　ureB基因，其核苷酸序列与参考文献［5］中报道的ureB序列相比较有61个碱基不同，同源性为96.44％。然而Hp 菌株基因水平的多态性并没有改变基因表达的蛋白序列^［10］，根据所得基因序列推定的氨基酸序列与之比较，两者的同源性高达99.65％，仅有2个氨基酸有所不同：分别为第200位的苏氨酸和第353位的缬氨酸，并且尿素酶B基因序列的改变多为氨基酸三联密码子简并性取代，或者为编码不影响酶活性的非保守性氨基酸的碱基取代。鉴于Hp尿素酶B基因存在的差异，可以对其进行PCR-RFLP分析，以区分不同来源的Hp菌株，必将在流行病学调查中有着广泛的应用。

　　在不同种属的尿素酶的研究中发现，尽管编码尿素酶的基因存在差异，但其氨基酸序列相当保守^［9］。TURRETT等比较了人Hp、鼬鼠螺杆菌（helicobacter　mustelae）、猫螺杆菌（helicobacter　felis，Hf）、平顶猴螺杆菌（H　nemestrinae）4种螺杆菌属的尿素酶N端氨基酸序列，UreB的同源性为95％～100％，高于UreA的同源性^［11］。由于UreB序列的高度保守性，使其成为了Hp疫苗研究的主要候选抗原。我们对克隆的ureB基因进行测序，得到了准确的核苷酸序列，据此推定出的氨基酸序列与GenBank所公布的氨基酸序列有着高度同源性，并且仅有的两个不相同氨基酸也只是非极性氨基酸，不会影响UreB蛋白的免疫原性，为ureB基因的表达和免疫原性研究奠定了基础。

　　［基金简介］ 国家重点科技攻关计划课题（96-901-01-54）

　　［作者简介］ 吴 超（1972－），男，重庆市人，讲师，硕士研究生，主要从事幽门螺杆菌诊断与防治的研究。

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