格林-巴利综合征患者幽门螺杆菌抗体测定

中国神经免疫学和神经病学杂志 2000年第2期第7卷 格林-巴利综合征专题

作者：朱永良　陆新良　忻琪君　杜勤　钱可大

单位：浙江大学医学院附属二院消化实验室，杭州　310009

　　关键词: 格林-巴利综合征；幽门螺杆菌

　　摘要： 目的　探讨幽门螺杆菌（Hp）感染与格林-巴利综合征（GBS）发病的相关性。方法　用免疫法对GBS及对照组血清、CSF进行Hp特异性IgA、IgG、IgM测定。结果 　49例GBS血清IgG含量为（48.62±57.30）　U/L，阳性率67.3%，对照组为（12.45±15.07）　U/L，阳性率35.9%，经统计学检验，t=4.87,x²=8.55，P均＜0.01；IgA分别为（8.62±9.19）　U/L、（5.48±4.12）　U/L（t=3.64,P＜0.01）；IgM分别为（20.58±26.43）　U/L、（13.06±17.52）　U/L（t=1.83,P＞0.05）。21例GBS　CSF　Hp特异性IgG为（4.19±4.21）　U/L，20例对照组为（2.21±0.34）　U/L（t=5.37,P＜0.01）；IgA分别为（2.89±1.21）　U/L、（2.54±0.67）　U/L（t=1.84,P＞0.05）；IgM分别为（4.41±1.83）　U/L、（3.98±1.02）　U/L（t=1.26,P＞0.05）。结论　 Hp抗体水平与GBS发病呈正相关，提示Hp感染可能是GBS发病诱因之一。

　　中图分类号： R745　　文献标识码： A　　文章编号： 1006-2963 （2000）02-083-04

Detection of Antibody to Helicobacter Pylori in Patients with Guillain-Barre Syndrome

ZHU Yong-liang　LU Xin-liang　XIN Qi-jun　DU Qin　QIAN Ke-da

　　（Gastroenterology Laboratory, The 2nd Affiliated Hospital, Medical College of Zhejiang University, Hangzhou 310009, China）

　　ABSTRACT： Objective　To investigate the relationship between infection of helicobacter pylori(Hp) and Guillain-Barre syndrome(GBS).Method 　An enzyme immunoassay was employed to determine the concentration of antibodies(IgA,IgG,IgM) in serum and CSF in patients with GBS and controls.Results The concentration of serum IgG in 49 patients with GBS was (48.62±57.30) U/L(x±s), positive rate 67.3%, but in 39 controls was only (12.45 ±15.07) U/L, positive rate 35.9%(t=4.87,P＜0.01); IgA was(8.62±9.19) U/L, (5.48±4.12) U/L, respectively(t=3.64,P＜0.01), but IgM was (20.58±26.43) U/L, (13.06±17.52) U/L, respectively (t=1.83,P＞0.05). The IgG in CSF 21 patients was (4.19±4.21) U/L, and (2.21±0.34) U/L in 20 controls(t=5.37,P＜0.01), however IgA was (2.89±1.21) U/L, (2.54±0.67) U/L( t=1.84,P＞0.05)；IgM was (4.41±1.83) U/L, (3.98±1.02) U/L(t=1.26,P＞0.05).Conclusion The concentration of Hp antibodies has positive relationship with GBS, it suggests that the infection of Hp may be of an inducing factor of GBS.

　　Key words: helicobacter pylori; Guillain-Barre syndrome▲

　　幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌的发生发展密切相关，且已被国际抗癌联盟列为I类致癌物^［1］。近来研究表明，Hp感染还与其它疾病相关^［2,3］。格林-巴利综合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）是一种周围神经系统急性炎症性脱髓鞘疾病，其病因及发病机制尚未完全阐明。多数学者认为它是一种感染后自身免疫变态反应性疾病，空肠弯曲菌是引起GBS最常见的感染因素之一^［4,5］。Hp的生物学性状与空肠弯曲菌相似，是否也是引起GBS的感染因素迄今国内外尚未见报道。本研究采用酶免疫法（ELISA）测定了GBS患者和对照组血清、CSF　Hp特异性IgA、IgG、IgM，以探讨Hp感染与GBS之间的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　试剂：Hp标准菌株NCTC11637（美国ATCC），Hp培养基（梅里埃生物制品研究所，法国），羊抗人IgA、IgG、IgM酶标记抗体（DAKO公司，丹麦），人抗Hp特异性IgA、IgG、IgM（自制，采用亲和层析制备）。

　　1.1.2　 样本：血清标本共88例，其中GBS 49例（男35例，女14例），年龄14～79岁，平均（36.0±16.8）岁。GBS诊断符合Asbury诊断标准^［6］。对照组39例（男27例，女12例），皆为献血员，年龄24～50岁，平均（33.6±13.1）岁。以上血清均新鲜分离，分装后置-20 ℃保存备用。同时收集21例GBS患者CSF（男13例，女8例），年龄20～70 岁，平均（41.2±12.9）岁，对照组20例为非GBS神经科住院患者。

　　1.2　方法

　　1.2.1　Hp抗原制备与鉴定： 收集20株从患者胃粘膜分离的Hp和NCTC11637标准菌株均在Hp培养基上增菌培养，经微需氧环境48 h后，用生理盐水洗下菌苔，离心洗涤3次，超声粉碎30 sⅹ5次，置4 ℃ 1周后吸取上清液，过交联有兔抗空肠弯曲菌抗体的Sepharose 4 B亲和层析柱，浓缩流出液，再用Sephadex G-200纯化，混合蛋白质峰，用聚丙酰胺电泳测得Hp纯化抗原含有2条蛋白质区带（相对分子质量分别为130 000和53 000）。Hp纯化抗原与空肠弯曲菌交叉性抗原测定采用蛋白质免疫印迹法。将上述制备的Hp抗原先用聚丙酰胺电泳4 h，然后用转移电泳印迹于硝酸纤维膜（4 ℃、12 h），将印迹有蛋白质的硝酸纤维膜先用10%（体积分数）小牛血清白蛋白封闭1 h后，加入兔抗空肠弯曲菌抗体37 ℃结合2 h，再洗膜5次，加入羊抗兔IgG酶标抗体（1∶100）结合2 h，洗膜5次，用四氨基联苯胺显色，流水终止反应，同时设立对照。

　　1.2.2　血清Hp特异性IgA、IgG、IgM测定： 上述制备的Hp抗原以1∶200稀释后包被微孔，4 ℃过夜，次日取出用10%（体积分数）小牛血清封闭30 min后，洗涤2次，加入待检血清（IgA血清1∶50，IgG 1∶200，IgM 1∶50稀释）和标准品37 ℃反应30 min后，洗涤3次，加入酶标抗体（抗人IgG-HRP 1∶4 000，抗人IgA-HRP 1∶2 000，抗人IgM-HRP 1∶2 000）37 ℃温育20 min后，洗涤3次，用邻苯二胺显色5～10 min，1.8 mol/L H₂SO₄终止反应后用DG3022A型酶免疫计数仪测定各孔吸光度，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样品值。

　　1.2.3　Hp特异性Ig测定方法的特异性、敏感性及重复性评价：用30份经¹⁴C尿素呼气试验和W-S银染色均阳性血清以评价方法敏感性，以上述二法均阴性同时伴快速尿素酶试验和培养均阴性的血清以评价方法特异性^［1］。以同一样本同时测定20孔评价方法批内差异，以同一样本不同时间连续测定20次评价方法批间差异。

　　2　结果

　　2.1　GBS组和对照组血清Hp特异性IgA、IgG、IgM含量和阳性率比较　GBS血清Hp特异性IgA、IgG含量显著高于对照组，经t检验，t=3.64、4.87，P值均＜0.01，但IgM两组间差异无统计学意义（t=1.83，P＞0.05）（表1）。若以Hp感染阴性（¹⁴C尿素呼气试验、W-S银染色、快速尿素酶试验和细菌培养均阴性）血清的平均含量加2个标准差以上者作为Hp感染阳性标准。结果示GBS组Hp感染率显著高于对照组。提示Hp感染与GBS发病有关，但Hp近期感染则与GBS无关。

　　2.2　GBS组和对照组脑脊液Hp特异性IgA、IgG、IgM测定　 GBS组脑脊液Hp特异性IgG显著高于对照组（t=5.37，P＜0.01），而IgA、IgM则两组间差异无统计学意义（t=1.84、1.26，P均＞0.05）（表2）。

表1　GBS组和对照组血清Hp特异性IgA、IgG、IgM测定比较

　　Table 1　Comparison between IgA,IgG,IgM to Hp in serum from patients with GBS and controls (U/L, ±s)

　　* P＜0.01,#P＜0.01 ，△P＞0.05 compared with control, respectively

表 2　 GBS组和对照组脑脊液Hp特异性IgA、IgG、IgM测定

　　Table 2 　 Detection of IgA,IgG,IgM against Hp in CSF from patients with GBS and controls(U/L, ±s)

　　* P＞0.05,＃P＜0.01，△P＞0.05 compared with control, respectively

　　2.3　测定方法评价　 本方法测定的敏感性为90.2%，特异性93.6%，重复性100%，方法学批内差异7.6%，批间差异9.4%。采用蛋白质免疫印迹法鉴定结果表明Hp纯化抗原与空肠弯曲菌抗体无反应，提示与空肠弯曲菌无交叉抗原成分。

3　讨论

　　Hp于1983年由Marshall和Warren首次分离以来，引起了消化系学者的广泛关注^［7］。数年的研究证实，Hp感染不仅是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因之一，也与胃癌、胃粘膜相关淋巴组织样淋巴瘤的发病相当密切^［8］。Hp是一种专性微需氧的革兰阴性弯曲样细菌，由于其特有的高效脲酶得以在胃粘膜粘液层中定植，分泌多种毒性成分对胃粘膜细胞造成损伤。Hp感染具有以下特点：⑴长期性，不经抗Hp治疗感染可持续数年、数十年乃至终生。⑵易传染性，可通过口-口和粪-口传播。⑶不易根治，用单联或二联抗生素治疗Hp的根除率约60%。研究证实，Hp可诱发机体强烈的免疫应答。局部引起粘膜大量炎症细胞浸润及免疫反应，刺激机体产生多种细胞因子如TNF、IL-1、IL-6、IL-8和热休克蛋白等，并激活补体系统，引起组织炎症反应；Hp感染患者外周血的IFN-γ和LAK细胞增殖与杀伤力均显著低于Hp阴性患者。近年来文献报道Hp与慢性肾功能不全、肝硬化和冠心病等亦有关^［9］。

　　格林-巴利综合征是临床急性迟缓性瘫痪的常见原因之一。其发病机制尚未完全明了，由于此病大多起病急骤，约半数以上患者在发病前有急性感染病史，病程呈自限性，预后良好，所以认为GBS主要与空肠弯曲菌、巨细胞病毒、EB病毒、呼吸合胞病毒等感染有关。其中对空肠弯曲菌的研究较多。空肠弯曲菌可与神经组织间发生交叉免疫反应；对神经有毒素性损伤及诱导细胞免疫损伤^［4，5］。郑锦志等发现GBS患者存在细胞免疫功能的激活^［10］。

　　由于Hp与空肠弯曲菌有少量交叉抗原，因此在制备Hp纯化抗原时需先用空肠弯曲菌标准株超声粉碎抗原免疫家兔获得的抗体吸收交叉抗原，然后用蛋白质印迹法检测。结果表明Hp纯化抗原与空肠弯曲菌抗体无反应性，纯化的人抗Hp抗体与空肠弯曲菌粉碎抗原亦无反应性，确保了本研究结果的准确性。通过对血清、脑脊液Hp特异性抗体的测定表明，GBS患者Hp特异性IgG、IgA的阳性率和含量均显著高于对照组，提示Hp感染与GBS的发病有关。正常人群Hp感染率为50%以上^［1］，但临床GBS发病率并不高，可能因只有某些Hp菌株与GBS发病有关，或某些Hp菌株产生的毒素可突破机体的防御机制而对神经产生毒素性损伤。Hp诱导的免疫损伤有明显的个体易感性，与致病性空肠弯曲菌可能有交叉抗原。但均需进一步研究证实。■

　　作者简介：朱永良（1969-），男，浙江海盐县人，主管检验师，在读硕士。通讯地址：浙江大学医学院附属二院消化实验室，杭州 310009。联系电话：(0571)7783566。

　　参考文献：

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　　［6］　Asbury AK, Cornblath DR. Assessment of Current diagnostic criteria for Guillain-Barre syndrome［J］. Ann Neurol, 1990,27(suppl):21-24.

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　　［9］　范一宏，吕　宾，冯培芳，等. 幽门螺杆菌感染患者IFN-γ含量、LAK细胞活力与增殖的变化［J］. 浙江医学， 1998，20（5）：257-258.

　　［10］　郑锦志，张佩利，卢苗青，等. 格林-巴利综合征患者血清新蝶呤变化［J］. 中华神经科杂志， 1998，31（2）：74-75.

收稿日期：1998-11-10

　　修订日期：2000-01-05