幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 疫苗学

作者：李明峰　何志勇　凌贞　张迎春　沈旭东　吴祥甫

单位：李明峰 凌贞 张迎春 沈旭东(解放军第四五五医院消化内科)；何志勇 吴祥甫（中科院上海生物化学研究所）

关键词：幽门螺杆菌；热休克蛋白A；尿素酶B；基因重组双价疫苗

　　【 摘要 】　目的　构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白A亚单位(HspA)和尿素酶B亚单位(UreB)的重组蛋白质的侯选菌株。 方法　用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上分别扩增出HspA和UreB基因片段，将它们融合插入原核表达载体pET-22b(+)中，并在BL21(DE3)大肠杆菌表达。 结果　经测序，HspA-UreB(HU)融合基因片段由2061bp组成，为编码687个氨基酸残基的多肽。SDS-PAGE和免疫印迹分析检测发现，融合基因表达的蛋白相对分子质量约为78×10³，并证实该重组蛋白可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别，其免疫小鼠所得血清抗体可与纯化的HspA和UreB重组蛋白单体或融合体发生特异性的结合反应。同时观察到HspA的存在可使融合蛋白的尿素酶活性增加2倍以上。 结论　HspA-UreB融合蛋白有可能作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。

Construction of bivalent vaccine candidate expressing HspA

　　and UreB subunit from Helicobacter pylori

LI Mingfeng^*, HE Zhiyong, LING Zhen, et al.^*Department of Gastroenterology, 455 Hospital of PLA, Shanghai 200052, P.R.China

　　【 Abstract 】　Objective　Both heat-shock protein A subunit (HspA) and urease B (UreB) subunit as effective immunogen may stimulate the immunoresponse protecting human body against challenge of H.pylori. A recombinant strain which expresses bivalent antigen of HspA and UreB subunit was constructed. Methods　Gene encoding the structural A/B subunit of H.pylori heat-shock protein/ urease was amplified from H.pylori chromosomal DNA by PCR techniques. The genes were inserted into the prokaryotic expression vector pET-22b(+), and then was transformed into the BL-21(DE3) E.coli strain, expressed which HspA-UreB recombinant protein. Results　HspA-UreB gene was found to be 2061 base pairs ,the recombinant fusion protein encoded polypeptides of 687 amino acid residues, corresponding to calculated molecular masses of 78kD. Western blot analysis of HspA-UreB recombinant protein confirmed that it could be specifically recognized by the serum from H.pylori-infected patients, and could also be recognized by the serum from BALB/c mice immunized with HspA-UreB itself. The urease activity of E.coli cells containing the UreB gene plus the HspA gene was two times greater than that of UreB lonely. Conclusion　This result suggested that HspA-UreB recombinant protein may be an potential vaccine for control and treatment of H.pylori infection.

　　【 Subject words 】　Helicobacter pylori; Heat-shock protein A; Urease B; Bivalent genetic vaccine

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）是上消化道疾病的主要致病菌，它的感染与B型胃炎和消化性溃疡的发生密切相关，并被世界卫生组织列为胃癌发生的相关致病菌^〔1〕。Hp在我国普通人群中的感染率较高，尤其在北方地区和青少年当中其感染率高达(80～100)%。如何预防和根除Hp感染是目前临床治疗的重点。免疫疗法有望成为治疗该类感染性疾病的最有效、最有前景的方法之一。

　　在Hp的免疫治疗研究方面，纯化的尿素酶(urease, Ure) 和热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）及其亚单位成分均可以作为抗原免疫动物刺激机体产生保护性的免疫防御和治疗作用^〔2,3〕。进一步的研究发现，Hsp蛋白的亚单位A即HspA，因其独特的结构和能结合镍离子的特性，使其与Ure的B亚单位(UreB)同时表达时，可明显地增强尿素酶的生物活性达4倍以上^〔4〕，为此，本实验将HspA和UreB两个目的基因插入同一表达载体，并在大肠杆菌中得到了高效表达，为Hp疫苗的研制奠定了基础。

　　材料和方法

　　菌株和质粒：幽门螺杆菌H. pylori ATCC 43504由上海仁济医院消化病研究所萧树东教授惠赠；菌株TG1、BL21（DE3）、质粒pSK（+）、质粒pET-22b(+)为中科院上海生物化学研究所吴祥甫教授组保存。BALB/c小鼠购自中科院上海生物化学研究所动物房。

　　限制性内切酶及连接酶：T4 DNA连接酶、限制性内切酶、Klenow酶等均购自Gibco BRL公司；Taq DNA聚合酶为MBI公司产品；X-gal、IPTG为Boehringer Mannheim公司产品；羊抗人IgG-辣根过氧化物酶和兔抗鼠IgG-碱性磷酸酶均为华美生物工程公司产品。

　　血清及其它生化试剂：Hp感染阳性病人血清来自解放军第四五五医院内窥镜室。以病人的胃窦粘膜作尿素酶检测和病理组织切片染色观察是否为Hp感染阳性来筛选血清。选取Hp感染阳性患者血清10例，正常人血清4例。其余试剂均为进口或国产分析纯。

　　总DNA的提取：从固体培养基上刮取适量生长状态良好的Hp菌落，置入100 μl无菌去离子水中，制成含菌浓度约为10⁷个/ml的菌液，直接加热煮沸2min，离心取上清置-20℃保存备用。

　　HspA DNA和UreB DNA的扩增：分别取Hp总DNA量2μl，按常规PCR条件进行扩增，即94℃变性5min，加入2U的Taq DNA 聚合酶，按如下参数循环35次：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，最后一个循环结束后72℃反应10min。

　　重组克隆及DNA序列分析：质粒抽提、酶切反应、电泳鉴定、DNA片段回收、连接反应及细菌转化等均参照《分子克隆》一书的技术操作略加修改进行。DNA测序按自动测序方法进行。

　　结果

　　1.幽门螺杆菌HspA和UreB目的基因：根据Suerbaum等^〔5〕报道的HspA DNA序列和Labigne等^〔6〕报道的UreB DNA序列，经微机分析分别设计两对引物。HspA引物：P1为5′-GACATATGAAGTTTCAACCA

　　TAAGG- 3′，P2为5′-GGGATCCGTGTTTTTTGTGATCAT

　　GAC - 3′。引物P1为HspA 蛋白N端的编码序列，引入起始密码子ATG及NdeⅠ酶切位点；引物P2为HspA蛋白C端编码序列的互补序列，并引入一个BamHⅠ酶切位点。UreB引物：P1为5′-GAAGATCTA

　　AAAAGATTAGCAGAAAAG- 3′，P2为5′-GGCTCGAGC

　　TAGAAAATGCTAAAGAGTT- 3′，引物P1引入BglⅡ酶切位点，P2引入XhoⅠ酶切位点，以Hp总DNA为模板分别进行PCR扩增，得到两条DNA片段HspA和UreB，其大小分别为354bp和1707bp。

　　2.HspA和UreB基因的克隆及序列分析：将得到的两条PCR产物片段分别经Klenow酶补平，与经EcoRⅤ酶切的pSK(+)质粒在T4 DNA连接酶作用下，18～22℃连接过夜。然后转化大肠杆菌TG1，用NdeⅠ，BamHⅠ或BglⅡ，XhoⅠ双酶切鉴定含有插入片段的重组质粒，分别挑取两个阳性克隆作序列检测。

　　3.HspA和UreB基因的融合及序列分析：将克隆至pSK(+)质粒中的HspA和UreB基因片段分别以NdeⅠ，BamHⅠ或BglⅡ，XhoⅠ双酶切，低熔点胶分离纯化，以BamHⅠ和BglⅡ酶切位点的互补性，将上述两个目的基因在T4 DNA连接酶作用下融合插入同一表达载体pET-22b(+)中，构建大肠杆菌表达质粒pET-HU(图1)，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定含有插入片段的重组质粒，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，可得到一条长约2070bp的目的DNA片段(图2)，分别挑取两个阳性克隆作序列分析。

　　图1　重组质粒pET-HspA/UreB(pET-HU)的构建示意图

　　Fig 1. Schematic construction of plasmid pET-HspA/UreB(pET-HU)

　　图2　幽门螺杆菌HspA-UreB DNA的琼脂糖凝胶电泳

　　Fig 2. Agaros gel electrophoresis of HspA-UreB DNA from Helicobacter pylori

　　1. Marker DNA (1kb DNA ladder); 2. HspA-UreB DNA fragment

　　4.HspA和UreB融合基因在大肠杆菌中的表达：将表达质粒pET-HU转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选表达株BL-HU。将含表达质粒的单克隆菌落置于LB培养基（含氨苄青霉素100mg/L）中37℃培养至A600为0.4～0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导表达4h，离心收集菌体，进行SDS-PAGE（图3）。结果发现，经IPTG诱导后高效表达相对分子质量约为78×10³的蛋白，凝胶自动扫描分析，HspA-UreB重组蛋白表达量占菌体总蛋白的20%左右。

　　图3　HspA-UreB融合蛋白质的SDS-PAGE分析

　　Fig 3. SDS-PAGE analysis of HspA-UreB fusion protein expressed in BL21(DE3)

　　1. HspA cells before induction; 2. HspA cells after 4 h induction with iPTG; 3. HU cells after 4 h induction with IPTG; 4. HU cells before induction; 5. UreB cells after 4 h induction with IPTG; 6. UreB cells before induction; Mr. Molecular weight marker(14.5, 20, 30, 43, 67, 94)×10³

　　5.HspA-UreB融合表达蛋白的免疫印迹分析：以10%的凝胶作分离胶行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后将凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。含标准蛋白的膜用氨基黑染色，其余的膜用100g/L脱脂干奶粉封闭非特异性位点后，用Hp感染阳性病人的血清（1∶100稀释）作为一抗，羊抗人IgG-辣根过氧化物酶（1∶500稀释）作二抗，用含DAB的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为底物显色，同时取正常健康人的血清作阴性对照。结果发现在相对分子质量约为78×10³处有一阳性条带，而正常血清对照处则未显示条带。

　　6.HspA-UreB融合表达蛋白的纯化：BL-HU表达菌先经冻融法检测，HspA-UreB在菌体包含体内有高表达。将500ml LB培养基制备的BL-HU菌体溶于10ml连接缓冲液(20mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L咪唑，pH7.0)中，按常规过柱提纯，洗脱目的蛋白，将洗脱液作免疫印迹分析鉴定分离重组蛋白的纯度，结果发现在相对分子质量约78×10³处有一条带，其蛋白纯度约达85%以上(图4)。

　　图4　纯化的HspA-UreB融合表达蛋白的SDS-PAGE分析

　　Fig 4. SDS-PAGE analysis of purified HspA-UreB fusion protein

　　1. Molecular weight marker; 2. Purified fusion protein HspA-UreB; 3. Cells induction after 4 h with IPTG; 4. Cells before induction

　　7.HspA-UreB融合蛋白的免疫原性分析：选取6～8周龄的雌性BALB/c小鼠20只，分为2组，每组10只，分别予以小鼠尾背部皮下注射HspA-UreB融合蛋白和生理盐水。纯化的融合蛋白经生理盐水透析后制成质量浓度为50μg/ml，每次注射200μl，每周1次注射共4次，首次免疫加用福氏完全佐剂，末次免疫后3d取小鼠眶静脉血作抗体鉴定。结果发现，用融合蛋白免疫的小鼠血清均可与HspA，UreB及HspA-UreB重组蛋白发生特异性的结合反应，而生理盐水对照组的小鼠血清中未检测到该抗体。

　　8.融合蛋白尿素酶活性的检测：参照Cussac等^〔7〕报道的方法进行。反应物置于50℃水浴中，检测氨的释放量。以1μmol的尿素水解后可释放2μmol的氨为标准，以每分钟每毫克的菌体蛋白水解尿素的毫摩尔数来表示尿素酶的活性。结果发现重组蛋白UreB的尿素酶活性为每毫克(36.8±5.6)μmol ure/min，而融合蛋白HspA-UreB的尿素酶活性为每毫克(80.4±7.1)μmol ure/min，两者比较差异有非常显著性(P＜0.0001)。

　　讨论

　　Kansau等^〔4〕研究发现，幽门螺杆菌HspA的这一特殊结构，除其蛋白本身可以作为免疫原外，其结合金属镍离子的特性使得其与尿素酶基因共表达时，可使尿素酶活性增加4倍以上。本实验构建的pET-HU融合表达质粒，其DNA编码序列与单体HspA和UreB完全相同^〔8〕。与文献报道相比，HspA有3.4%（12/354）的编码碱基发生变异，2.5%（3/118）氨基酸序列不同^〔5〕，而UreB有2.2%（38/1707）的编码碱基发生变异，0.5%（3/569）氨基酸序列不同^〔6〕。分析出现变异的原因，认为（1）所采用的Hp的菌种不同；（2）Hp的菌株间的变异性较大，不同的病人感染的Hp具有其独特的限制性片段长度多态性(RFLP)谱型，尤其是不同地区差别更加明显，通常有好几个片段的差异^〔9〕。但其高度同源性又决定了不同的菌株间编码蛋白的主要抗原决定簇是一致的。本实验构建的融合蛋白，其HspA重组蛋白C端的27个氨基酸残基与文献报道完全一致，这一特殊结构使得融合蛋白的尿素酶活性较UreB单体的活性提高了1倍以上。对融合前后的重组蛋白进行二级结构分析发现，它们的构象尤其是融合蛋白的连接区域均与单体相同。这一融合蛋白的研制成功为提高疫苗的免疫原性提供了保证。

　　本实验在E.coli中表达的重组蛋白HspA-UreB，用免疫印迹法证实其蛋白相对分子质量约为78×10³。用HspA-UreB作为抗原包被平板，经ELISA检测发现，10例Hp感染阳性病人血清中有9例与融合蛋白HspA-UreB反应阳性，而4例正常人血清与之无交叉反应性。同时本实验用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，结果观察到，免疫的小鼠血清中均可检测到抗HspA和UreB的抗体，而对照组则无。由此初步认为，本实验制备的HspA-UreB融合蛋白可作为双价疫苗用于Hp的预防和治疗，关于其免疫保护或免疫增强作用正在作进一步的研究工作。

　　参考文献

　　1　Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP. Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinma. N Engl J Med, 1991, 325:1127-1131.

　　2　Gomez-Duarte OG, Lucas B, Yan ZX, et al. Protection of mice against gastric colonization by Helicobacter pylori by single oral dose immunization with attenuated Salmonella typhimurium producing urease subunits A and B. Vaccine, 1998, 16(5):460-471.

　　3　Ferrero RL, Thiberge J-M, Kansau I, et al. The Groes homologue of Helicobacter pylori confers protective immunity against mucosal infection in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 1995, 92:6499-6503.

　　4　Kansau I, Gullani F, Thiberge J-M, et al. Nickle binding and immunological propertis of the C-terminal domain of the Helicobacter pylori GroEs homologue(HspA). Mol Microbiol, 1996, 14(5):947-959.

　　5　Suerbaum S, Thiberge J-M, Kansau I, et al. Helicobacter pylori hspA-hspB heat-shock gene cluster: nucleotide sequence,expression, putative function and immunogenicty. Mol Microbiol, 1994, 14(5):959-974.

　　6　Labigne A, Cussac V, Courcoux P. Shuttle cloning and nucleotide sequences of Helicobacter pylori genes responsible for urease activity. J Bacteriol, 1991, 173(6):1920-1931.

　　7　Cussac G, Ferrero RL, Labigne A. Expression of Helicobacter pylori urease genes in Escherichia coli grown under nitrogen-limiting conditions . J Bacteriol, 1992, 174:2466-2473.

　　8　李明峰, 凌贞, 孙建新, 等. 幽门螺杆菌HspA基因的克隆, 表达及免疫原性研究. 生物化学和生物物理学报, 1999, 31(3):264-268.

　　9　Langenberg W, Rauws EAJ, Widjojokusumo A, et al. Identification of Campylobacter pylori isolates by restriction endonuclease DNA analysis. J Clin Microbiol, 1986, 24(3):414-417.

(收稿日期：1999-06-16)