胶体金免疫层析法检测抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A抗体

世界华人消化杂志 1999年第9期第7卷 研究原著

作者：韩锋产　阎小君　侯瑜　肖乐义　郭晏海　苏成芝

单位：中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所　陕西省西安市　710033

关键词：螺杆菌，幽门；细胞毒素相关蛋白A/ 分析；胶体金；免疫层析；抗体/ 分析

　　摘要　目的　建立一种快速、简易的检测血清中抗幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关蛋白A(CagA)抗体的胶体金免疫层析法(GICA).　方法　采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，将重组的CagA抗原划线固定于硝酸纤维素膜上，制成免疫层析检测试条. 血清中IgG与测试条上金标记物结合后沿着硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条.　结果　用GICA与ELISA试剂盒对比检测了326份血清标本中抗CagA抗体，本方法的特异性为95.8%，敏感性为97.3%，两法符合率为96.6%.　结论　GICA检测血清中的抗CagA抗体特异性强、灵敏度高、简便快速，无需特殊仪器设备，有广泛应用价值.

　　中国图书馆分类号　R 573

Gold immunochromatographic assay for anti-Helicobacter pylori antibody

HAN Feng-Chan, YAN Xiao-Jun, HOU YU, XIAO Le-Yi, GUO Yan-Hai and SU Cheng-Zhi

　　Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China

　　Abstract　AIM　To develop a rapid, simple and self-performing gold immunochromatographic assay (GICA) for the detection of anti-cytotoxin associated gene A(CagA) protein of Helicobacter pylori in sera.　METHODS　With prepared GICA apparatus and colloidal gold which were coupled with protein A(SPA), the gold-SPA conjugate reacted with human IgG in serum and migrated along the nitrocellose strip on which the CagA was immobilized. If the serum contained anti-CagA IgG, there would be a red line on the strip where the CagA was immobilized.　RESULTS　A total of 326 sera of patients and healthy people were detected for anti-CagA IgG by GICA and ELISA. The sensitivity and specificity of GICA were 95.8% and 97.3%. The corresponding rate of both tests was 96.6%.　CONCLUSION　GICA is a sensitive, specific, simple and rapid assay for detecting anti-CagA IgG in sera.

　　Subject headings　Helicobacter pylori; cytotoxin associated gene A/ analysis; colloidal gold; immunochromatography; antibody/ analysis

　　0　引言

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp) 与上消化道疾病的发生有十分密切的关系. 国外报道，人群中约有一半感染了Hp，其中约50%的Hp菌株表达细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin associated gene A protein, CagA). 目前国内尚缺乏CagA阳性Hp感染的流行病学资料. 我们拟建立简单而快速检测抗Hp-CagA抗体的胶体金免疫层析法(gold immunochr_omatography assay, GICA).

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　氯金酸(HAuCl·Cl₃·4H₂O)：成都化学试剂厂产品：葡萄球菌A蛋白(SPA)：卫生部上海生物制品研究所；细胞毒素相关蛋白A(CagA)：基因工程产品，本所制备；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗CagA-IgG试剂盒：上海晶莹生物制品公司；血清标本：由第四军医大学中心血库及消化内科提供；Z 323 K低温高速离心机：德国；LGJ 0.5-Ⅱ冷冻干燥机：军事医学科学院实验仪器厂；点膜器：美国Bio-Dot公司.

　　1.2　方法

　　1.2.1　15 nm胶体金的制备　参照文献［4］进行. 其步骤为：去离子水溶解氯金酸使其终浓度为0.2 g/ L，煮沸后每100 mL加入10 g/ L柠檬酸三钠水溶液4 mL，继续煮沸7min. 电镜观察胶体金的粒度.

　　1.2.2　免疫胶体金的制备　取颗粒直径为15 nm的胶体金100 mL，用0.1 mol/ L K₂CO₃调至pH 6.2，在搅拌状态下加入SPA(1 g/ L) 0.6 mL，继续搅拌10min；加入50 g/ L BSA 10 mL，继续搅拌5min. 4℃下3000 r/ min离心5min，弃沉淀，上清液以12 000 r/ min离心15min，小心移去上清液，沉淀即为制备的胶体金. 用20 mL悬浮液悬浮沉淀，以吸水纤维吸附后冷冻干燥4 h，4℃保存备用.

　　1.2.3　免疫层析测试条的制备　测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成. 吸水纤维部分附着有胶体金免疫复合物；在硝酸纤维素膜上用CagA(1.5 mg/ L)及人IgG(1 mg/ L)划线(1 mm宽)，分别作为检测线和对照线，晾干，用50 g/ L BSA封闭2 h，以0.01 mol/ L PBS洗涤3次，干燥后依次粘于白色塑料片(支持物)上，切成0.5 cm×10 cm的试条，加干燥剂密封保存.

　　1.2.4　抗Hp-CagA IgG的检测　以新鲜血清为佳. 试管中加入0.1 mL～0.2 mL血清，将测试条含有金标记物的一端插入血清内即可. 结果判定：以测试条硝酸纤维素膜上出现两条红色条带为抗Hp-CagA IgG阳性；仅出现一条红色条带(靠近吸水滤纸端，对照线)为阴性. 如果无红色条带出现则视为试剂失效. 结果确定时间：强阳性标本在5min内即可在检测线处见到红色胶体金颗粒聚集；弱阳性标本约需要10min确定结果.

　　2　结果

　　2.1　胶体金颗粒直径的电镜观察　用预先处理好的覆盖有Formvar膜的镍网侵入胶体金溶液中，取出放入空气中干燥，然后在透射电镜下观察，可见胶体金颗粒大小均匀一致，颗粒直径约为15 nm(图1).

图1　胶体金颗粒的透射电镜观察结果.

　　2.2　试剂盒的特异性及敏感度　采用本实验所建立的胶体金免疫层析法与ELISA试剂盒对比检测西京医院门诊及住院326例患者血清中的抗Hp-CagA IgG，结果见表1.

表1　GICA与ELISA检测结果比较

　　由表1可见，若以ELISA检测抗Hp-CagA抗体试剂盒作为参照标准，则GICA法的特异性为95.8%，敏感度为97.3%，总符合率为96.6%.

　　2.3　稳定性试验　GICA试剂盒于4℃下放置6 mo，每月检测抗Hp-CagA IgG阳性及阴性血清各50份，该试剂盒的各种性能指标均稳定. 将GICA试条于37℃温箱放置6 d，做热稳定性试验，与放置4℃的试条对照，结果无明显差别.3　讨论

　　免疫层析是出现于20世纪80年代初期的一种独特的免疫分析方式. Beggs et al^［1］于1990年首次报道了斑点免疫层析试验(dot immunochromatographic assay, DICA),用以检测孕妇尿液中的HCG进行早孕诊断，继而有采用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原^［2］及抗HCV-IgG^［3］的报道. 本文建立的胶体金免疫层析快速检测抗Hp-CagA抗体的方法集中了免疫与层析色谱的特点，使待测样品中的IgG与吸水纤维上的金标SPA不断结合，形成IgG-金标SPA复合物，再由层析作用，持续通过硝酸纤维素膜，与膜上固相CagA结合. 该方法具有以下特点：①敏感度高：由于在试验中所有样品均经过狭窄的硝酸纤维素膜，实际上是对被测的物质起到了浓缩的作用，从而使免疫层析比免疫渗滤法更为敏感，与ELISA检测的敏感度相近. ②特异性强：本试剂盒采用高活性的重组CagA纯品作抗原，极大地提高了检测的特异性. 胶体金及免疫胶体金的性能，也是影响特异性的一个重要因素. 研究中我们结合有关文献［4-6］，经过不断的试验，制备了适合本方法开展的直径为15 nm的胶体金颗粒，并最大限度地提高标记的效率. ③稳定性及重复性好：免疫胶体金的稳定性是影响试剂盒质量的一个重要因素. 免疫胶体金的制备，是金颗粒表面吸附蛋白质以形成牢固结合的过程. 该过程受酸碱度、离子强度、免疫胶体金的浓度、温度等因素的影响，其中主要取决于pH值. 为此，我们优化了胶体金标记的最佳条件和免疫胶体金悬浮的最佳配方，使该试剂保存时间延长. ④操作简便：本试剂盒的核心部分仅为一个试条，构造十分简单；结果显示为红色的条带，判断非常容易；操作更是方便，不需任何设备，特别适应于中小型医院， 医师诊所和急诊检验，并可在家中测试. ⑤快速：GICA操作过程一般仅需几分钟，最长不超过10min；而在ELISA操作中，由于涉及加血清、标记物、底物及繁复的洗板等步骤，约需2 h方可完成.

　　研究表明，CagA阳性Hp感染与上消化道疾病的关系更为密切^［7-9］. 来自亚太地区的研究提示，Hp感染者中CagA阳性Hp感染率相当高^［10-12］. 为适应大面积的CagA阳性Hp的筛选，本文所建立的检测血清中抗CagA IgG的方法无疑对于CagA阳性Hp感染的快速诊断有重要意义. 由于GICA检测血清标本中抗CagA IgG具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、简易快速、无须仪器设备等优点，因而有广泛应用前景.

　　通讯作者　韩锋产，710033，陕西省西安市长乐西路17号，第四军医大学全军基因诊断技术研究所.

　　作者简介：韩锋产，男，1963-05-08生，陕西省咸阳市人，汉族. 1985年延安大学医学系毕业，1990年西安医科大学生物化学硕士，1995年第四军医大学生物化学博士，主要从事基因诊断方面的研究工作，发表论文12篇.

　　Correspondence to:HAN Feng-Chan, Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, Fourth Military Medical University, 17 Changle Xilu, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China

　　Tel. +86·29·3374771

　　Email.Hanfc@263.net

　　4　参考文献

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收稿日期　1999-05-24　修回日期　1999-07-25