幽门螺杆菌空泡毒作用及空泡毒中和试验
中华医学检验杂志 1999年第2期第0卷 论著摘要
作者：施理 向友华 戴立人 侯晓华 易粹琼 张锦坤
单位：510515 广州，南方医院消化病研究所(施理)；同济医科大学附属协和医院(向友华、戴立人、侯晓华、易粹琼、张锦坤)
关键词： 幽门螺杆菌；中和试验；空泡毒作用
【摘要】 目的 探讨幽门螺杆菌(helicobacter pylori, Hp)的空泡毒作用及其与疾病的关系。方法 用细胞培养观察Hp的空泡毒作用。结果 69.35%(43/62株)的Hp空泡毒作用阳性，其空泡毒作用能被相应患者血清中和。78.26%(36/46例)的消化性溃疡患者，感染的是空泡毒作用阳性的Hp＋(Toxin＋)，而只有42.86%(6/14例)胃炎患者感染的是Hp+，两者Hp+感染率差异有显著性(χ2=4.83,P＜0.05)。结论 Hp+感染与消化性溃疡密切相关，其在体内也有空泡毒作用并产生相应抗体。
Vacuolationg inoculated by helicobacter pylori and neutralization assay SHI Li*, XIANG Youhua, DAI Liren, et al. * Department of Gastroenterology, Union Hospital, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective To study the vacuolation of Helicobacter pylori (Hp) and its relation with disease.Methods Cytoculture was used to study the vacuolation induced by Hp.Results 69.35% (43/62 strains) of Hp was vacuolated and could be neutralized by serum from related patients. 78.26% (36/46 cases) of patients with peptic ulcer were infected with Hp+ (Toxin+) strains, and only 42.86% (6/14 cases) of patients with gastritis were infected with Hp+ strains. There (χ2=4.83, P＜0.05).Conclusions Infection with Hp+ (Toxin+) was more often associated with peptic ulcer disease. Hp+ was vacuolated and produced antibodies in vivo.
【Key words】 Helicobacter pylori Neutralization assay Vacuolation
自1983年Warren与Mashall从人胃粘膜分离出幽门螺杆菌(helicobacter pylory, Hp)后，人们逐渐认识到Hp是胃炎、消化性溃疡的病因;然而困扰人们的是，为何感染Hp后，有些患者最终发展成为消化性溃疡，而另一些仅仅是胃炎；提示部分Hp致病力较强，感染这部分Hp往往导致消化性溃疡。1988年Leunk［2］发现部分Hp菌株能产生一种使体外培养的哺乳细胞产生空泡样变的毒素，据此将Hp分为空泡毒作用阳性的Hp+(Toxin＋)及空泡毒作用阴性的Hp-(Toxin-)；并发现Hp+较Hp-致病力强，Hp+能引起试验动物广泛而严重的炎症、糜烂甚至溃疡，而Hp-或不能定植在胃粘膜上或仅引起较轻的炎症。消化性溃疡患者大多感染的是Hp+，而胃炎患者大多感染的是Hp-［3］。本试验通过对临床分离Hp菌株的空泡毒作用观察及患者血清能否中和其空泡毒作用；对Hp空泡毒作用，及在体内是否也有空泡毒作用，作一初步研究。
材料与方法
一、材料
1.病例选择：选择近期未服过治疗消化性溃疡、抗Hp药物，接受胃镜检查的患者94例；男52例，平均年龄44.4±8.1(16～64)岁；女42例，平均年龄40.2±7.7(19～60)岁。94例中，患消化性溃疡59例，胃炎29例，胃癌6例。诊断以内镜结合病理检查为标准。内镜下，距幽门3～5 cm沿胃窦大小弯各取2块；1块用于Hp 尿素酶试纸快速诊断Hp，若为阳性，大小弯各1块则用划线接种法接种于改良布氏琼脂羊血培养基上。还有一块送病理检查。同时取静脉血，血清56℃加热30分钟，-20℃保存。
2.仪器、试剂：DY-2厌氧培养箱(浙江义乌冷冻机厂)，SCP50CO2细胞培养箱(湖南)，倒置显微镜(日本)；改良布氏琼脂培养基(上海卫生防疫站)，1640培养基(Gibical公司)。
二、方法
1.Hp分离培养、鉴定、培养滤液制备：将上述接种的平皿，在37℃、微需氧环境中培养7天。将培养出来的菌落，经涂片革兰染色、鞭毛检查、生化鉴定,证实是Hp的单个菌落接种在含15% 小牛血清的改良布氏肉汤中，经增菌、离心、过滤(0.22 μm微孔滤膜)，制备Hp培养滤液。
2.Hp培养滤液对Vero细胞的作用：以倍比稀释法，将Hp培养滤液加入在96孔细胞培养板上生长良好的Vero细胞培养液内，每一个Hp培养滤液做2个重复孔，并将未接种Hp 的改良布氏肉汤的滤液作为阴性对照。
3.血清中和试验：同2，向生长有Vero细胞的96孔细胞培养板培养液内，加入Hp培养滤液及等体积的同一患者血清，每1例做2个重复孔。
4.观察指标及结果判定：(1)培养体系pH测定：在培养开始，24小时、48小时分别检测加入Hp培养滤液的Vero细胞培养体系的pH值。(2)空泡毒作用及血清中和试验结果判定：空泡毒作用判定：将培养液加有Hp培养滤液的Vero细胞培养2天后，在倒置显微镜下观察，若40%以上Vero细胞出现空泡样变化，则判为空泡毒试验阳性，Hp培养滤液含空泡毒素，Hp为空泡毒素阳性；出现阳性结果的最高稀释度为其空泡毒作用滴度。加入等体积同一患者血清后，若Hp+空泡毒作用消失，则为中和试验阳性。
5.统计方法：χ2检验。
结果
1.Hp+在各种Hp相关性胃肠疾病中的感染情况：我们从94例Hp相关性胃肠疾病患者中,分离出62株Hp，43株为Hp+占69.35%，19株为Hp-占30.65%(表1)。
表1 Hp+在各种Hp相关性胃肠疾病中的分布
| 疾病 |
Hp株数 |
Hp+株数(%) |
| 消化性溃疡 |
46 |
36(78.26)** |
| 十二指肠球部溃疡 |
32 |
27(84.38)** |
| 胃溃疡 |
10 |
6(60)* |
| 复合性溃疡 |
4 |
3(75)* |
| 胃炎 |
14 |
6(42.86) |
| 胃癌 |
2 |
1(50) |
与胃炎比较：** P＜0.05，* P＞0.05
从表1可知，78.26%（36/46）的消化性溃疡患者感染的是Hp+，而只有42.86%（6/14）胃炎患者感染Hp+，两者之间差异有显著性(χ2=4.83,P＜0.05)。十二指肠球部溃疡患者中，Hp+感染率最高（84.38%）；胃溃疡、复合性溃疡患者的Hp＋感染率也高于胃炎患者的Hp+感染率，但无统计学意义(χ2=0.17，χ2=0.32,P均＞0.05)。
2.Hp培养滤液加入Vero细胞培养液后，体系pH值的变化：加入Hp培养滤液后0小时、24小时、48小时，Hp+组与Hp-组之间pH值比较，差异不明显(P＞0.05)(表2) 。加入Hp＋，Hp培养滤液24小时、48小时，与加入前比较,体系pH值也差异无显著性(P＞0.05)(表2)。
表2 加入Hp培养滤液后培养体系的pH值(x±1.96s)
| 培养时间(h) |
Hp+组 |
Hp-组 |
P值 |
| 0 |
7.36±0.36 |
7.37±0.39 |
＞0.05 |
| 24 |
6.92±0.51 |
6.85±0.41 |
＞0.05 |
| 48 |
6.01±0.47 |
6.19±0.45 |
＞0.05 |
| |
P＞0.05 |
P＞0.05 |
|
3.空泡毒作用观察： Hp＋培养滤液作用8小时后，部分Vero细胞出现小的空泡，随培养时间增加，越来越多的Vero细胞呈现空泡样变；而且空泡数目逐惭增多， 体积逐惭增大， 2天后空泡毒作用最强，但Vero细胞仍贴壁生长；4天后细胞逐惭死亡，漂浮在培养液中。 阴性对照滤液组，加入培养滤液作用4天，Vero细胞形态无明显改变。大多数Hp+(41株)空泡毒作用滴度，小于1∶4；1株为1∶8；1株1∶16，是从十二指肠球部溃疡患者中分离出来的。
4.Hp+空泡毒作用的中和试验：43株Hp(Toxin＋)的培养滤液，与相对应患者血清共同作用于Vero细胞，发现原有的空泡毒作用消失，Vero细胞胞浆内没有空泡形成，显示中和试验阳性；而19株Hp-的培养滤液，与相对应患者血清共同作用于Vero细胞，空泡毒作用仍为阴性，中和试验阴性。以空泡毒作用滴度最高的Hp＋培养滤液，与所有患者血清共同作用于Vero细胞，发现Hp+相对应患者血清能使其空泡毒作用消失；而19株Hp-相对应患者血清却没有这种作用。
讨论
体外培养的哺乳细胞出现空泡样变是培养体系生化特性发生变化（如pH变化等）、营养缺乏、毒素作用时，细胞表现的一种病理生理现象［5］。我们的研究表明，只有空泡毒作用阳性的Hp培养滤液能使Vero 细胞产生空泡样变；布氏肉汤及空泡毒作用阴性的Hp培养滤液没有此种作用。表明Vero 细胞空泡样变不是由于营养缺乏引起的。我们也发现，Hp＋与Hp-两组培养滤液加入Vero细胞培养体系，培养0小时、24小时、48小时，pH值均有下降，但在各个时刻，两组培养体系pH值之间无显著性差异(P＞0.05)。说明空泡样变也不是由于培养体系生化特性变化引起的，而是由Hp+本身产生的空泡毒素引起的。
Hp＋培养滤液引起的Vero细胞空泡样变， 随作用时间延长，越来越多的Vero细胞呈现空泡样变；而且空泡的体积逐惭增大，数目逐惭增多，表明空泡毒作用继续加重。而细胞2天后仍贴壁生长，表明空泡毒素对Vero细胞的毒性作用暂时是非致死性的。但出现空泡的细胞4天后逐惭死亡 ,表明这种空泡毒作用是一渐进性的过程，出现空泡的细胞仍有生命活性，但随空泡毒作用的继续，细胞不可避免地死亡。现代研究表明，细菌毒素引起的细胞空泡样变是细胞内质网、高尔基体的膜包绕毒素或受损细胞器形成的吞噬小体，并与初级溶酶体融合成为次极溶酶体。后者释放作用极强的各种消化酶，分解毒素及受损的细胞器，同时也进一步损伤细胞，形成更多更大的吞噬小体。由于这是一个逐渐加重的病理过程，表现出空泡样变的细胞，空泡体积逐渐增大，数目逐渐增多，最终死亡。
在本试验中，由于用的是培养滤液，排除了Hp直接作用的可能，表明这种空泡毒作用是由Hp＋分泌的一种毒素引起的，这与以往的认识明显不同，以往认为Hp直接与组织上皮细胞形成“蒂”样结构，直接损伤组织细胞。我们的试验还发现，Hp＋培养滤液与相应患者血清共同作用于体外培养的Vero细胞，其原有的空泡毒作用消失，而所有的Hp-培养滤液均没有这种作用。 由于血清经过56℃30分钟加热灭活补体，表明这种中和试验是不依赖补体的抗原-抗体反应，Hp＋培养滤液含有可溶性抗原——空泡毒素，血清中含有抗空泡毒素的抗体，同时也表明Hp＋在体内也分泌空泡毒素，产生空泡毒作用，并刺激机体产生抗空泡毒素的抗体。以空泡毒作用滴度最高的Hp＋培养滤液与所有感染Hp＋的患者血清共同作用于体外培养的Vero细胞，发现血清中和试验均阳性，表明不同Hp＋菌株，其空泡毒素抗原性相同。目前国外已提纯了空泡毒素，一种分子量为87KDa的蛋白质——空泡毒素抗原(Vacuolating toxin antigen,VacA) 。用免疫印迹及酶联免疫吸附方法，发现Hp＋感染者血液及胃液中均含有抗VacA的抗体。
我们的研究表明，消化性溃疡患者大多感染的是Hp+，占其感染Hp总数的78.26%(36/46)。而胃炎患者则较少感染Hp，占其感染Hp总数的42.86%(6/14)，两者之间差异有显著性(P＜0.05)，表明Hp＋感染与消化性溃疡关系密切。自1983年Mashal成功地从患者胃内分离培养出幽门弯曲菌(Campylobacter pylori,1988年更名为幽门螺杆菌Helicobacter pylori，Hp)，一系列研究证实Hp是胃炎、消化性溃疡尤其是十二指肠球部溃疡的病因，近年还发现Hp与胃癌有关。国外利用分离培养Hp＋,或检测患者血液的抗VacA抗体，诊断Hp＋感染，预测患者患消化性溃疡的可能性，并给予积极的治疗。由于不同Hp+的VacA，均具有相同的抗原性，国外也积极从事VacA作为疫苗预防Hp＋感染的研究。我们的研究证实了，国内消化性溃疡患者与Hp＋感染也是密切相关，分离培养Hp＋或检测患者血液的抗VacA抗体，对预测患消化性溃疡可能性，有一定帮助。
参考文献
1 Cover TL, Vcofe L, Lekce K, et al. The pathobiology of campylobacter infections. Annu Rev Med, 1989, 40:269-285.
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3 Schmitl K, Judje J, Kusa K, et al. Genetic analysis of the H. P. Vacuolating cytotoxin structural similarities with the IgA protease type of exported protein. Mol. microbiol, 1994；12:307-319.
4 Timothyl N,Casve H,Adgce A, et al. Characterization of human serologic response to proteins in H. P. broth culture supernatants with vacuolizing cytotoxin activity. Infect and Immune. 1992, 58: 603-609.
5 Dunn WA, Jetsm K, Jryit K, et al. Studies on the mechanisms of autophagy: formation of the autophagic vacuole. J Cell Biol, 1990, 110:1823-1933.
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(收稿：1998-05-11 修回：1998-11-20)
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