EGF对用或未用MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞生长的影响

中国地方病学杂志 2000年第5期第19卷 实验研究

作者：董惠芬　蒋明森　明珍平　钟沁萍　杨明义

单位：湖北医科大学 寄生虫学教研室 血吸虫病研究室，湖北 武汉 430071

关键词：日本血吸虫；培养细胞；表皮生长因子；甲基 硝基亚硝基胍；细胞生长

　　［摘要］　目的　研究表皮生长因子（E GF）对用或未用甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱导的日本血吸虫成虫培养细胞的促生长 、增殖作用。方法　将联合法接种培养至第3天的日本血吸虫成虫培养 细胞，一部分在含EGF终浓度分别为0、0.5、1、2、4、8、12、16、20、 24、28 ng/ml的附加20％小牛血清及常量抗菌素的RPMI-1640培养基中培养 ；另一部分，先用含MNNG终浓度为3 μg/ml附加20％小牛血清和常量抗生素的RP MI-1640培养基处理48h，再换用含终浓度分别为0、1、8、12、16、20 ng /ml的EGF培养基继续培养。每日用Olympus IM倒置显微镜观察细胞生长和增殖情况。结果　两实验组中，用不同浓度EGF处理后的日本血吸 虫成虫培养细胞均在2周以后出现不同程度的脱落、退化；并且，随着EGF浓度的升高， 培养细胞脱落、退化的现象更加严重；两实验组相比，未用MNNG诱导的培养细胞出现脱 落和退化现象的时间比用MNNG诱导的相对更早。结论　外加EGF对用或未用MNNG诱导的日本血吸虫 成虫培养细胞的生长增殖均无促进作用，相反，加速了培养细胞的老化，尤其是对未用MN NG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞，这种作用更加明显。

　　［中图分类号］ Q958.9　［文献标识码］ A　　　［ 文章编号］1000-4955(2000)05-347-03

The function EGE on the proliferation of cultured Xchistosoma japonicum cells treated with or without MNNG

DONG Hui-fen，JIANG ming-sen，MING Zheng-ping，et al

　　(Department of Medical Parasitology and Research Laboratory of Schis tosomiasis，Hubei Medical University，Wuhan 430071，China)

　　Abstract： Objective　To study the effects of EGF on the growth and proliferation of cultured cells from adult Schistosoma japonicum.Methods Cells collected from the adult Schist osoma japonicum were cultured in medium RPMI-1640 containing 20% calf serum and a moderate amount of antibiotics for 3 days,they were divided into two groups.T he cells in the first group were directly treated by EGF with concentrations of 0,0.5,1,2,,4,8,12,16,20,24 and 28 ng/ml,respectively.The cells in the second gro up were designed to treat by MNNG of 3 μg/ml for 48 hours before they were cult ured in the medium with EGF of 1,8,12,16 and 20 ng/ml,respectively.The growth an d proliferation of cultured cells were observed by microscope everyday.Results Some of the cultured cells in the medium with d ifferent concentration of EGF fell off and degenerated in both groups after two weeks.Moreover,along with the increase of the EGF concentration in the medium,th e abscission and degeneration of the cells became serious.Cultured cells in the first group fell off or degenerated earlier than those in the second group.Conclusions EGF cannot induce the proliferation of the cultured cells from adult Schistosoma japonicum.On the contrary,it can accelerat e the degeneration of the cultured cells,especially for the cells not treated by MNNG.

　　Key words： Schistosoma japonium; Cultured cells; eGF; M NNG; Cell proliferation

　　近年来，有关血吸虫细胞培养的研究有了显著的进展^［1～15］ ，但尚未能在体外建立一个无限增殖的培养细胞系。Hobbs等^［1］测试过多种淋巴 液、组织抽提液、黏附因子、激素及生长因子等，发现这些物质对血吸虫培养细胞的增殖均 无促进作用。Coles等^［2］以不同浓度的诱变剂EMS处理曼氏血吸虫培养细胞， 未观察到预期的分裂增殖现象。董惠芬等^［5］以PHA诱导日本血吸 虫成虫培养细胞，在光镜和电镜下观察到培养细胞有分裂现象；作者曾以不同浓度的甲基硝 基亚硝基胍（MNNG）处理日本血吸虫成虫培养细胞，发现MNNG对培养细胞具有一定 的促生长增殖作用（待发表资料）；本文研究表皮生长因子（EGF）对用或未用MNNG 诱导的日本血吸虫成虫培养细胞生长的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞培养　按董惠芬等^［6］方法略作改动，虫龄为28 d，小牛血清为武汉亚 法生物技术公司产品，培养方法为联合法。

　　1.2　EGF及MNNG处理　取接种后第3 d的日本血吸虫成虫培养细胞，一部分在含EGF(Sigma公司)终 浓度分别为0、0.5、1、2、4、8、12、16、20、24、28 ng/ml的RPMI-1640及20％小 牛血清和常量抗生素的培养基中培养；另一部分先用含MNNG终浓度为3 μg/ml的培养 基处理48 h后，再用EGF终浓度分别为0、1、8、12、16、20 ng/ml的RPMI-164 0附加20％小牛血清和常量抗生素的培养基培养。

　　1.3　培养细胞的观察　接种后，每天用Olympus IM倒置显微镜观察培养细胞的生长及增殖情况，必 要时进行拍照。除观察到正常的培养细胞外，还可观察到：①退化细胞：细胞变圆，体积变 大，立体感、透明度及均质性消失，轮廓变模糊，胞质内出现颗粒状和空泡状物质，最后细 胞裂解；②脱落细胞：细胞不贴壁，悬浮于培养液中；③坏死细胞：胞质仍均质透明，但细 胞膜已破损，细胞内容物漏出。

　　2　结果

　　2.1　EGF及MNNG处理前培养细胞的状况　此时的培养细胞均质透明，立体感强，胞质少，核质比例大，细胞器结构不 清；均贴壁呈片生长，以中小型的圆颗粒状和多角形细胞为主，亦可见三角形、鞭毛形、大 圆细胞等。有少量退化细胞，根据经验判断这些细胞是属于成熟卵黄细胞，还有极少的脱落 细胞及组织飘浮于培养液中；未观察到坏死细胞。

　　2.2　EGF对用或未用MNNG诱导的培养细胞的影响

　　2.2.1　EGF对未用MNNG诱导各浓度组培养细胞的影响　用浓度分别 为0（对照）、0.5、1、2、4、8、12、16 ng/ml的EGF处理后的各组培养细胞在培养第 1周内其形态、数量等各方面均无差别，细胞贴壁生长，立体感强，透明均质，核质比例大 ，均匀分布，以中小型圆细胞和多角形细胞为主，有少量退化细胞和极少的脱落细胞；EG F浓度为20、24、28 ng/ml的3组细胞虽然形态与上述各组相差不大，但细胞数量大大 减少，培养液中出现呈片状或团块状脱落细胞。

　　培养至第2周，对照组培养细胞数量、形态与第1周未见有任何变化；0.5、1、2、4、8 ng / ml各组培养细胞数量减少，散在分布，细胞均质透明，小圆细胞为主，大而圆的退化细胞以 及脱落细胞较多，可见坏死细胞；12、16、20 ng/ml各组细胞数量显著减少，细胞小而圆， 散在分布，原来正常的一些培养细胞胞质内开始出现颗粒状和空泡状物质，透明度降低，细 胞立体感渐失，退化现象明显，坏死细胞也增多，培养液中还出现大量成团或小片状的脱落 细胞。24、28 ng/ml组细胞数量很少，零星分布，细胞小、圆，折光性差，胞质内有颗粒物 质，坏死细胞多，也有大片脱落细胞。

　　培养至第4周，对照组细胞数量仍很多，均匀分布，细胞贴壁好，立体感强，均质透明，核 质比例大，以中小圆形及多角形细胞为主；退化细胞、脱落细胞少，未见明显的坏死细胞； 0.5、1、2、4 ng/ml细胞数量明显减少，散在分布，也可观察到呈片状的细胞，细胞小而圆 ，透明性降低，折光差的退化细胞增多，坏死细胞也增多；8、12、16、20 ng/ml各 实验组培养细胞数量极少，细胞小而圆，培养细胞内颗粒物质增多而使细胞颜色加深，均 质性差，坏死细胞多；24、28ng/ml二组细胞数量极少，不再继续培养。

　　培养至第6周时，对照组数量、形态与前述无多大变化；0.5、1、2、4 ng/ml细胞数量减少 ，点状分散分布，细胞小而圆，轮廓深，胞质内有细小颗粒，呈退化状态，退化细胞、坏死 细胞多，脱落细胞少；8、12、16、20ng/ml组，细胞极少，偶见几个，且多呈退化 状态；未观察到脱落细胞、坏死细胞。

　　2.2.2　EGF对用MNNG诱导后各浓度组培养细胞的影响　培养第1周 时，0、1、8、12、16、20 ng/ml各浓度组培养细胞形态、数量等均无差异,与未诱导的细胞 相似。培养至第2周时，0 ng/ml培养细胞与对照组相似；1、8、12、16、20 ng/ ml各实验组均质透明的细胞数量减少，以小圆细胞为主，退化细胞增多，坏死细胞少，培养 液中可见有团块状的脱落细胞。

　　培养至第4周时，0 ng/ml组细胞数量比对照组多，生长良好，有部分培养细胞体积明显变 大，退化细胞少，无脱落细胞；1、8 ng/ml两组细胞数量明显减少，多为小圆细胞，坏死 细胞增多；仍可观察到团块状脱落细胞；12、16、20 ng/ml各组细胞数量更少，散在 分布，均质性下降，胞质内有细小颗粒的退化细胞增多；脱落细胞呈片状、块状，坏死细胞 多。

　　培养第6周的0 ng/ml组细胞均匀片状分布，均质透明，中型圆细胞为主，生长优于对照组 ，退化细胞少，未见脱落细胞；1、8 ng/ml两组细胞数量少，分散分布，小而圆，呈退化 状态，坏死细胞增多，脱落细胞少；12、16、20 ng/ml各组细胞稀少，星点状分布， 呈退化状态，脱落细胞、坏死细胞少。

　　3　讨论

　　EGF是细胞因子之一，而细胞因子具有双向调节功能：即低浓度的促 进作用与高浓度的抑制作用。本实验中，我们观察到：当EGF浓度超过12 ng/ml时，未用 MNNG诱导的培养细胞第2周时就出现大量脱落，退化现象明显，并发生细胞膜破损而坏 死；诱导后的培养细胞EGF浓度越高这种现象越明显，由此表明EGF浓度高于12 ng/ ml时，即已显著超过了培养细胞的需要量，这不仅不能促进日本血吸虫成虫培养细胞的生长 、繁殖，反而产生明显的破坏作用，如：细胞贴壁能力下降与大量脱落；细胞老化过程缩短 ，退化加快；细胞膜稳定性降低，易破损而使培养细胞发生坏死。当EGF浓度在8 ng/ml 以下时，浓度越 低，细胞存活时间相对越长，细胞脱落、退化也相对较少，与对照组比较，仍表现出细胞生 长抑制现象，这与Hobbs等^［1］的研究结果是一致的。我们推测，日本血吸虫成虫 培养细胞对EGF的需要量甚微，血清中存在的生长因子即可满足其生长需要。因此，培 养细胞并不需要外源EGF。

　　此外，细胞因子发挥其生物学效应的前提是必须与靶细胞表面相应的受体结合，靶细胞表面 细胞因子受体的多少和亲和力的高低，直接关系到靶细胞对细胞因子作用的敏感性。结果表 明：EGF各浓度实验组均未表现出预期的细胞分裂增殖或转化现象，这可能与日本血吸虫 培养细胞表面的EGF受体数量少或二者的亲和力低有关，以至加入EGF后，培养液中E GF浓度过高而出现细胞抑制;另外，日本血吸虫细胞在培养过程中能释放出一些可溶性物 质，这些物质可能会抑制相应细胞因子对靶细胞的作用。

　　研究中我们发现，用MNNG诱导日本血吸虫成虫培养细胞，可使培养细胞发生一定程度的 分裂，而当MNNG的浓度为3 μg/ml，处理时间为48 h时，效果最佳（待发表资料） ； 但EGF对用MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞的生长增殖无促进作用，相反，还加 速了培养细胞的老化，表明MNNG与EGF在促日本血吸虫培养细胞分裂、增殖方面无协 同作用，这可能与MNNG不能使培养细胞表面的EGF受体的数目增加或亲和力增强有关 。因此，当在用MNNG诱导的培养细胞中加入不同浓度的EGF培养时，仍表现出EG F对培养细胞的破坏作用。

　　综上所述，EGF对用或未用MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞均无促分裂增殖作用 。

　　［基金来源］湖北省自然科学基金（97J075），湖北省教委青年基 金与武汉市青年科技晨光计划资助项目（985708235）

　　［作者简介］ 董惠芬(1964-)，女，副教授，硕士。

［参考文献］

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　　［15］　董惠芬，蒋明森，李　瑛，等.日本血吸虫细胞形态的初步观察［A］ .见中国动物学会寄生虫专业学会成立10周年纪念论文集［M］.北京：中国科学技术出 版社，1995.131-133.

［收稿日期］1999-11-12