邻苯二甲酸酐哮喘大鼠模型的制备及实验免疫学观察

中华劳动卫生职业病杂志 1998年第6期第0卷 论著

作者：赵振东　刘镜愉　陈明　丁丽华

单位：赵振东　刘镜愉　陈明　丁丽华　100085 北京医科大学第三临床医学院职业病研究中心

关键词：邻苯二甲酸酐；职业性哮喘；动物模型；发病机制

　　【摘要】　目的　进一步研究苯酐哮喘的发病机制，建立苯酐哮喘大鼠模型并观察其体内抗原特异性IgG和IgE的变化。方法　苯酐致敏大鼠抗原攻击后描记呼吸曲线以监测气道反应，酶联免疫吸附试验及被动皮肤致敏试验检测抗原特异性IgG和IgE。结果　苯酐可引起大鼠气道高反应性和体内抗原特异性IgG和IgE水平升高。结论　苯酐哮喘属半抗原致敏变应性哮喘。该实验所建模型可用于苯酐哮喘发病机制的进一步研究。

Development of the rat model of occupational asthma sensitized by phthalic anhydride and immunologic observation

Zhao Zhendong,Liu Jingyu,Chen ming,et al.

　　research Center of Occupational Medicine,Third Teaching Hospital of Beijing medical University,Beijing 100083.

　　【Abstract】　Objective　To promote the study of the pathogenesis of occupational asthma further,the rat model of occupational asthma sensitized by phthalic anhydride was developed,the level of specific IgG and IgE in rat serum were observed.Methods　Monitoring the airway responsiveness by describing breath curve with physiologic recorder;investigating the specific IgG and IgE level with ELISA and PCA method.Results　Airway hyperresponsiveness can be induced in this model,while the increased specific IgG and IgE in rat serum can be observed. conclusion　Phthalic anhydride induced asthma is of allergic asthma,the developed rat model can be used for investigating the pathogenesis of occupational asthma further.

　　【Key words】　Phthalic anhydride　　Occuaptional asthma　　Animal model

　　pathogenesis

　　邻苯二甲酸酐(苯酐,Phthalic anhydride,PA)，是常见的职业性致喘物之一，其致喘机制仍不很清楚。一般认为:变态反应、药理学作用、神经源性和遗传机制同职业性哮喘的发病机制有关，但变态反应机制特别是IgE介导的速发型变态反应占有重要地位^［1］。有较多的报道认为PA接触工人血清中存在特异IgE抗体，支气管激发试验也证明了这类抗体与临床表现有相关性^［2，3］。特异性IgG水平也有明显升高，但其临床作用尚不明显^［3］。由于致敏豚鼠气道反应性与人相近而常被作为动物模型进行职业性哮喘的研究，我们于“七五”期间曾成功地制备了PA哮喘豚鼠模型^［4］，但用于豚鼠的实验材料来源比较困难且很难得到较纯品系的豚鼠，故建立新的苯酐哮喘动物模型对进一步研究其发病机制有着重要的意义。本文将探讨建立苯酐哮喘大鼠模型方法及观察其体内抗原特异性IgE和IgG水平的变化。

　　材料和方法

　　1.苯酐-牛血清白蛋白结合物(PA-Bovine serum albumin,PA-BSA)制备：30 mg PA(分析纯，北京化工二厂)溶于1 ml1，4-二氧六环，然后在冰浴中逐滴加入2%的 BSA/0.1 mmol NaHCO₃溶液，苯酐与BSA的摩尔比为60∶1，在该温度下于通风橱中磁力搅拌18小时，使形成PA-BSA，随后在pH7.4的NH₄HCO₃溶液中透析6次，每4小时换液1次。紫外分光光度计测蛋白浓度，真空冷冻干燥后分装，-20℃保存^［5，6］。

　　2.动物致敏：0.09 g PA溶于500 μl二氧六环，再加植物油至3 ml，制成半抗原溶液(浓度3% W/V，现用现配)。取12只雄性SD大鼠，体重250～300 g(北京医科大学实验动物部提供)，随机分为两组，每组6只。按0.2 ml/100 g体重以5%氯胺酮腹腔麻醉后，背部备皮，分两点皮内注射上述半抗原溶液，每点0.05 ml。再取12只SD大鼠同样分组和操作，只是用生理盐水(NS)代替半抗原溶液。第2和第3周用同样方法加强免疫。

　　3.抗原吸入激发及记录方法：(1)固定大鼠，用胶布环绕贴于大鼠腹部靠近肋弓下缘，松紧适度，连一细线于传感器(CJZ型)弹簧片上，传感器导线再与生理记录仪(日立056型)连接。激发前描记一段正常呼吸曲线。(2)PA-BSA和BSA以NS1∶1?000稀释，然后向PA免疫的两组大鼠气道内分别滴入0.1 ml pA-BSA和BSA，观察记录半小时。另外两组皮内注射NS的SD大鼠以同样方法分别用NS和PA-BSA激发。(3)被动转移试验：取上述激发阳性的动物血清6份，每份1 ml，分别给6只正常SD大鼠静脉注射。15小时后进行抗原吸入激发(方法、步骤同上)。

　　4.抗原特异性S-IgG测定：酶联免疫吸附试验法(ELISA法)。100μl含PA-BAS(50 μ/ml)的0.5 mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液包被凹孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小时。用0.02 MPBS-0.5%Tween 20洗4次，每次5分钟。加入1∶5稀释的待检血清100微升/孔，37℃孵育90分钟。洗4次后加入单克隆小鼠抗大鼠IgG-HRP(军事医学科学院五所)100微升/孔，置37℃90分钟，洗4次，加入0.02%OPD(中山生物制品公司)-0.01%H₂O₂/pH5.0柠檬酸缓冲液100微升/孔，37 ℃放置30分钟，4 mmol H₂SO₄50微升/孔终止反应。DG 3022型酶标仪492 nm测吸光度(A,曾称光密度OD)。

　　5.S-IgG抑制试验：用阳性PA-S-IgG大鼠血清与同体积不同浓度的PA-BSA37 ℃孵育2小时，以100微升/孔加入由PA-BAS碳酸盐缓冲液包被过的凹孔聚苯乙烯板中，随后步骤同上。

　　6.S-IgE测定：被动皮肤致敏试验法(PCA法)。取6份抗原激发阳性大鼠血清，分成灭活IgE?4份和非灭活IgE?2份(灭活方法:56℃恒温水浴1小时)。取6只正常大鼠分为3组，每组2只，背部备皮。第1组和第2组大鼠沿脊柱两侧皮内注射灭活IgE血清，每点0.1 ml，第3组大鼠注射非灭活IgE血清。3小时后，第1组大鼠每只静脉注射1%伊文斯蓝0.95 ml和1∶1?000 PA-BSA 0.05 ml，观察30分钟。72小时后，第2组和第3组大鼠进行同样操作。背部皮肤出现蓝斑为阳性。

　　7.数据处理：两均数间的比较用t检验。

　　结果

　　1.气道激发及被动转移试验结果:对照组18只大鼠分别气道滴入NS、PA-BSA及BSA后，半小时内无一出现哮喘发作。实验组6只大鼠气道滴入PA-BSA35分钟后，均出现不同程度的哮喘发作。大鼠一般表现为呼吸频率加快，呼吸幅度增大。哮喘发作时可伴有咳嗽、喷嚏，重者呼吸极度费力，挣扎。发作一般持续30～50分钟。6只正常大鼠静脉注射激发阳性的大鼠血清后进行抗原吸入激发，也均出现不同程度的哮喘。

　　2.ELISA结果:所有PA致敏大鼠均产生了大量的PA-S-IgG抗体(0.72±0.09)，与NS激发对照组(0.18±0.02)和PA-BSA激发对照组(0.19±0.11)相比，差异均有显著意义(P＜0.01)。

　　3.S-IgG抑制试验:PA-BSA对S-IgG有明显的抑制作用，2 μg/ml、20μg/ml和2?000 μg/ml的PA-BSA对S-IgG的抑制率分别为54.6%、78.9%、83.6%和89.2%(图1)。

图1　S-IgG抑制试验

　　Fig 1　Inhibition test of S-IgG

　　4.PCA试验结果:第1组动物用灭活IgE的血清皮内注射3小时后静脉注射伊文斯蓝PA-BSA液，注射后6分钟动物皮肤局部出现蓝斑。第2组动物用灭活IgE的血清皮内注射72小时后静脉注射伊文斯蓝PA-BSA液，注射后半小时内动物皮肤局部均无蓝斑出现。第3组动物用不灭活IgE的血清皮内注射72小时后静脉注射伊文斯蓝PA-BSA液，注射后15分钟动物皮肤局部均出现蓝斑。

　　讨论

　　1.气道高反应性是哮喘的一个重要特征^［7］，也是评价哮喘动物模型是否成功的一个指标^［8］。本实验采用SD大鼠以PA致敏，结果发现PA-BSA激发6只大鼠均出现不同程度的呼吸幅度增大和呼吸频率增快，表明PA致敏可导致SD大鼠气道高反应性的产生。

　　2.PA是低分子量化合物，属半抗原物质，进入机体后需与蛋白结合成全抗原,形成新的抗原决定簇而发挥致敏作用^［9］。本实验采用PA致敏，单给以抗原载体蛋白BSA无喘息发作，说明BSA与大鼠血清白蛋白无交叉作用，但吸入PA-BSA后出现了喘息发作，说明大鼠体内产生了针对PA全抗原的特异性抗体。用NS免疫大鼠PA-BSA抗原攻击后无任何反应，说明实验组的反应阳性属免疫学机制，即属于变应性哮喘而不属于非特异性刺激。被动转移哮喘阳性血清的大鼠抗原攻击后出现喘息反应，进一步证明PA致敏大鼠体内存在抗原特异性抗体。这完全符合变应性哮喘的特征。

　　3.临床上已证明PA哮喘患者体内可测得抗原特异性IgG和IgE抗体，一般认为PA哮喘是IgE抗体介导的速发型变态反应，IgG也参与其发生^［2，3］。本实验采用ELISA法测定了PA致敏组大鼠体内IgG抗体，与NS免疫组大鼠及空白对照组大鼠相比有明显的S-IgG升高。S-IgG抑制试验也表明该抗体事先给予不同含量的抗原，可产生不同程度的抑制。这证明PA致敏大鼠体内存在具有半抗原特异性的S-IgG，但PA-BSA量增加很多时对S-IgG的抑制率却没有很明显的增加，其原因还不很清楚。

　　另外，IgE与组织有较强的亲和力，致敏肥大细胞后可介导24～72小时的PCA反应。IgE不耐热，56℃1小时可改变其Fc段的构型而失去其致敏肥大细胞的作用。IgG虽也能与肥大细胞结合，与IgE有类似作用，但其在细胞上持续存在的时间十分短暂，一般不超过4小时，大约在注射10小时内从局部皮肤消失。IgG耐热，56℃1小时不能改变其致敏肥大细胞的活性。据此，本实验用加热灭活IgE后的血清3小时PCA反应阳性，72小时后PCA反应阴性，而同时注入体内的非灭活IgE血清72小时PCA则是阳性蓝斑反应。这说明PA哮喘大鼠体内同时存在IgG和IgE型特异性抗体，这与以往报道的豚鼠哮喘模型相一致^［4］。

　　综上所述，本次实验所建PA致敏大鼠模型是成功的，且同时证明速发型变态反应在PA哮喘发病机制中起着重要作用。

　　参考文献

　　1.Chang YM,Malo JL.Aetiological agents in occupational asthma.Eur Respir J,1994,7:346～351.

　　2.Baur X,Czuppon A.Diagnostic of specific IgE antibody concentrations,skin prick testing,and challenge tests in different chemical works with symptoms of sensitivity to different anhydrides.J Allergy Clin Immunol,1995,96:489～494.

　　3.Nielsen J,Welinder H,Schutz A,et al.Specific antibodies against phthalic anhydride in occupational exposed subjects.J Allergy Clin Immunol,1988,82:126～133.

　　4.张星东，刘镜愉.邻苯二甲酸酐哮喘动物模型的被动皮肤过敏实验.中华劳动卫生职业病杂志，1995，13：274～275.

　　5.Topping MD,Venables KM,Luczynska CM,et al.Specificity of the human IgE response to inhaled acid anhydrides.J Allergy Clin Immunol,1986,77:834～842.

　　6.Welinder H,Zhang XD,Gustavsson C,et al.Structure-activity relationships of organic acid anhydrides as antigens in animal model.Toxicology,1995,103:127～136.

　　7.Venables KM,Chan YM.Occuaptional asthma.Lancet,1997,349:1465～1469.

　　8.Karol MH.Animal models of occupational asthma.Eur Respir J,1994,7:555～568.

　　9.Blagini RE,Bernstein DI,Gallagher JS,et al.Immune response of cynomolgus monkeys to phthalic anhydride.J Allergy Clin Immunol,1988,82:23～29.

收稿：1998-02-05

修回：1998-04-28