早老性痴呆转基因小鼠的研究

中国老年学杂志 2000年第1期第20卷 实验研究

作者：秦川　常洋　朱华　尹红星　高虹　刘亚莉

单位：中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所，北京　100021

关键词：早老性痴呆；APP；转基因；动物模型

　　摘　要　目的　建立早老性痴呆的转基因小鼠，为进一步的发病机理研究及药物筛选提供动物模型。方法　显微注射方法制备转基因小鼠，通过PCR、Southern杂交鉴定。结果　质粒pPdAP751的Tth111Ⅰ+XbaⅠ双酶切片段长度为4.3kb，经回收、纯化后，注射到小鼠受精卵的雄性原核，经PCR、Southern杂交鉴定，确定首建鼠一只。首建鼠现已传代建系。结论　通过显微注射的方法，建立了早老性痴呆的转基因动物模型。

Study of the Transgenic mice model of Alzheimer disease by use of Human Mutant APP gene

Qin Chuan,Chang Yang,Zhu Hua et al

　　(Institute of Laboratory Animal Science,Chinese Academy of Medical Science.Beijing 100021)

　　Abstract：Objective　For the etiopathological studies and drug development Alzheimer disease(AD),the transgenic mice of AD were used.Methods　Obtain the transgenic mice by microinjection,and confirmed by polymerase chair reaction(PCR) and Southern blot.Results　The transgene was isolated by Tth111I+XbaI from the recombinant pPDAP751,and purified by equilibrium centrifugation in CsC1 gradient.Transgene was microinjected into the male pronucleus of the zygotes.The founder was tested by PCR and Southern blot.Conclusions　By microinjection,the transgenic mice of AD were establish,which carry the human mutant APP cDNA751.

　　Key words　animal model of Alzheimer disease　APP　transgene

　　早老性痴呆(Alzheimer's disease,AD)病因研究和药物筛选的主要障碍是缺少一个合适的动物模型。虽然化学方法，免疫方法甚至将多肽直接注入啮齿类动物脑内^〔1〕的努力都已尝试，但都不是很理想。利用转基因技术复制人类疾病动物模型，已成为一个主要发展方向^〔2，3〕。我们构建了APP cDNA751转基因，通过显微注射方法制备转基因小鼠，为进一步的发病机理研究提供了很好的动物模型。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　限制性内切酶及主要生化试剂　限制性内切酶及Taq DNA聚合酶购于Promega公司及华美生物工程公司。一般化学试剂均为国产分析纯。乳酸钠、透明质酸酶、矿物油购于Sigma公司(embryo tested)。

　　1.1.2　动物品系　种公鼠BDF1，10 w龄以上。供卵鼠KM，4～6 w龄，体重12～14 g。结扎公鼠KM/ICR，10 w龄以上。受体鼠(假孕鼠)KM/ICR，8 w龄以上，体重30 g以上。

　　1.1.3　主要仪器　倒置显微镜、显微操作系统、解剖、钟表镊、CO₂孵箱、DNA合成仪(PE480)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　制备转基因　在前期的工作中，我们利用定向克隆技术，构建了PDGF启动子调控下的含有全长突变人APP cDNA V717Ⅰ的质粒 pPDAP751。重组体利用LipofectAMINE(GIBCOBRL)介导转染SY5Y神经母细胞瘤细胞，经Northern杂交检测到表达质粒。pPDAP751的Tth111Ⅰ+XbaⅠ双酶切片段长度为4.3kb(图1)，透析袋法进行回收，氯化铯超离纯化(图2)。注射缓冲液为7.5 mmol/L Tris(pH7.4)与0.175 mmol/L EDTA。

　　1.2.2　转基因操作及提取　鼠尾DNA按Brigid Hogon等方法^〔4〕。

　　1.2.3　鼠尾DNA的PCR检测　本实验共设计两对引物，分别位于转基因片段的5’端和3’端。

图1　PPdAP751的Tth111Ⅰ+XbaⅠ双酶切片段

　　P1为5’-GTCACCCCTAGTTCTTTTT-3’，P2 5’-GGTAGACTTCTTGGCAATAC-3’，PCR循环：94 ℃5 min预变性；94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃1 min，30个循环；72 ℃10 min延长。

　　R1为5’-CCGATGATGACGAGGACGAT-3’，R2为5’-TGAACACGTGACGAGGCCGA-3’，PCR循环：94 ℃5 min预变性；94 ℃60 s，60 ℃40 s，72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃10 min延长。

图2　回收转基因片断电泳图，1%Agrose

　　1.2.4　Southern杂交　采用DIG高效随机引物标记与检测试剂盒Ⅰ(Boehringer Mannheim,Germany)。

　　1.2.5　转基因鼠传代、建系　阳性鼠与正常鼠杂交，筛选携带有外源基因的F1代杂合子，同窝互交得到1/4比例的纯合子。

　　2　结　果

　　2.1　我们共移卵1 053枚，出生115只。仔鼠出生3～4 w后，经PCR、Southern杂交检测尾DNA，得到1只阳性鼠(TG99#，雌)。

　　2.2　鼠尾DNA用两对引物初步筛选，为提高PCR的特异性，我们将引物分别设计在来自不同基因的片断中。同时参考APP基因组约180kb，含有18个外显子，将P1设计在PDGF启动子的3’端，P2设计在APP cDNA的5端第2外显子与第3外显子连接处。PCR扩增产物574 bp，中间含有单一HindⅢ酶切位点可对扩增产物进一步鉴定。R1位于APP基因组第6外显子内，R2位于第11与12外显子连接处，扩增APP751cDNA的产物为692 bp。PCR鉴定结果见图3。

图3　PCR鉴定结果，2%Agrose

图4　Southern杂交结果

图5　F1代PCR鉴定结果1.2%Agrose

　　2.3　经PCR筛选阳性的TG99#鼠，鼠尾DNAHindⅢ酶切后，经Southern杂交进一步鉴定，探针选用，对照鼠选用同窝PCR反应阴性鼠作对照。阳性对照为APP751转基因回收片断。杂交结果显示，TG99#为阳性鼠，即确定为人APP751cDNA V717Ⅰ转基因首建鼠(图4)。

　　2.4　Tg99#首建鼠8 w龄后，与正常C57雄交配，第一窝共产仔13只，仔鼠经PCR检测阳性7只。F1代阳性率53.8%(7/13)，接近50%(图5)。F1代阳性鼠同窝互交，F2代正在鉴定纯合子。

　　3　讨　论

　　AD的基本病理表现在广泛分布在大脑皮层和海马结构的β-淀粉样斑块。斑块的主要成分是由β-淀粉样前体蛋白(β-APP)衍生的38～42个氨基酸的有神经毒性的多肽(Aβ，β/A4)。APP有多种剪接形式，其中695、751、770为主要形式。APP751和APP770都包含在结构和功能上已知的蛋白酶抑制子(Kunitz protease inhibitor,KPI)编码区。APP是一个大的跨膜蛋白，包含一些功能区域。KPI区丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶和因子Ⅳ。包含KPI形式的APP可能在全身有多种作用^〔4〕，KPI区也可能促进细胞分裂和提高细胞生存能力。在AD病人的海马回和皮层中APP695与APP751的比率异常，且与脑中这些部位斑块的数量呈正相关。在家族性AD(FAD)患者中已鉴别出多个APP基因的突变位点，其中位于跨膜区中第717位的氨基酸发生V-I、V-G、V-F突变，此位点距Aβ仅4个AA.已在M17成纤维细胞瘤细胞中发现V717I突变可增加A4(1～42)与A4(1～40)的比例，而前者正是选择性地沉积在斑块核心的主要成分，证明这些突变是致病性的^〔5〕。然而APP基因的突变仅占FAD的5%，说明另有其他因素导致APP基因的异常代谢而产生Aβ。APP的代谢过程复杂而且至今还未完全清楚，APP在细胞内存在不同的代谢途径，在21三体综合征(Down综合征)中，患者形成AD的频率也增高。现有的研究结果证明，APP基因的突变及异常表达可以部分解释多肽的降解及AD的发病机制^〔5，6〕。

　　1980年Cordon等以玻璃针刺进受精卵的雄原核，注入DNA溶液，成功地获得转基因动物。我们建立人APP cDNA V717Ⅰ转基因鼠主要目的是在动物脑部表达hAPP，以研究APP加工和代谢的基本过程，希望通过转基因动物模型能较好地理解AD发病进程以及应用于最终的治疗研究。

　　本课题获国家科技部资助

　　作者简介：秦川，女，39岁，副教授，研究方向：神经病理

　　参考文献

　　1，Games D，Khan K M，Sorinao FG et al.Lack of Alzheimer pathology after β-amyloid protein injections in rat brain.Neurobiol Aging，1992；13：569

　　2，Lars L,Rronnie F,Abdul HM et al.Alzheimer's disease:molecular genetics and transgenic animal model.Behavioral Brain Research，1993；57：207

　　3，Adriano A,Sebastian B,Ulrich S et al.Transgenic and knock-out mice:models of neurological disease.Brain Pathol,1994；4：3

　　4，Jie K，Hans-Georg L,Unterbeek A et al.The precursor of Alzheimer's disease amyolid A4 protein resembles a cell-surface receptor.Nature，1987；32(19)：733

　　5，Suzujki N，Tobum T,Cai XD et al.An increase percentage of long amyloid β-protein secreted by familial amyloid β protein precursor(βAPP717)mutations.Science，1994；264：1336

　　6，Steven A J，Thomas M,Babara C et al.Relation of neuronal APP-751/APP-695 mRNA ration and neuritic plaque density in Alzheimer's disease.Science，1990；248：854

收稿日期：1999-01-14