乙脑病毒持续感染模型中变异株性状及NS3区序列分析

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 抗感染免疫

作者：冯国和　张琳　王玉梅　石理兰　赵桂珍　乔光彦

单位：110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院传染科

关键词：流行性乙型脑炎病毒感染；NS3区序列分析

　　【 摘要 】　目的　研究乙脑病毒变异性状与NS3区基因序列的关系。 方法　应用乙脑病毒野生株及一种人肝癌细胞KN73建立持续感染模型，采用标准胰蛋白酶消化技术进行细胞传代，经反复冻融法收集细胞内变异病毒。采用BHK细胞空斑实验方法进行病毒滴定，利用NS3区特异引物进行逆转录-多聚酶链反应以获NS3区基因片段，应用ABI-PRSM^TM310测序系统进行序列分析。 结果　在早期（感染后24～36h）细胞培养液中病毒量为10⁶PFU/ml，在后期（感染后3年）细胞培养液中病毒量为10^3～4PFU/ml，细胞内病毒含量一直维持在10^2～3PFU/ml水平。NS3区测序结果可见：位于核苷酸碱基序列上第66位C→U，第72位A→C，第294位U→C，第306位A→G及第342位A→G，但相应编码的氨基酸未发生变异。 结论　变异株存在性状变异，即增殖性低于野生株；NS3区编码蛋白对野生株及变异株均至关重要，亦提示病毒性状变异的原因可能由其它区域蛋白变异或病毒与宿主间蛋白相互作用所致。

Characterization and NS3 sequence analysis of mutant strains during persistent infection of KN73 cells with Japanese encephalitis virus

FENG Guohe, ZHANG Lin, WAMG Yumei, et al.

　　（Department of Infectious Disease, The Second Clinical College of China Medical University, Shenyang 110003, P. R. China）

　　【 Abstract 】　Objective　To study on the relationship between the characterization and NS3 sequence analysis of mutant strains during persistent infection of KN73 cells with Japanese encephalitis viruses. Methods　Persistent infection model was established by the standard strains of Japanese encephalitis viruses and human hepatoma cells line. Cells were subcultured weekly by standard trypsinization techniques. Cell-associated viruses of persistently infected cells were collected by the method of freezing and melting alternate. Viral titers were examined by plaque methods using BHK cells NS3 region of mutant virus strain from infected cells was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using specific primers. PCR products were purified using agarose gel, and then directly sequenced by ABI-PRSN^TM310 sequencing system. Results　In the early phase (24-36hr) post-infection, virus titers of culture fluids in KN73 cells infected with JaGAr-01 were 10⁶ PFU/ml. They were 10^3-4PFU/ml in the late phase (3 years) post-infection. The cell-associated viruses in KN73 cells infected with JaGAr-01 were 10^2-3PFU/ml. Sequence analysis of NS3 region from mutant viruses was found that the amino acids did not change though some based encoding them changed. Conclusions　The reproduction of the mutant viruses were lower than that of the standard virus JaGAr-01. The protein encoded by NS3 region was very important for both the standard and the mutant viruses JaGAr-01. It was pointed out that the reason of virus mutation was resulted from protein encoded by other nucleotides sequences, or from the cooperation between virus and host protein.

　　【 Subject words 】Japanese encephalitis virus infection; NS3 sequence analysis

　　诸多病毒性疾病慢性化的原因是由于病毒持续感染宿主细胞。持续感染成立的条件，是病毒在其复制及转录过程中，需改变自身特点而成为变异株，从而逃避宿主细胞免疫杀伤^〔1〕。然而，病毒变异株在持续感染中确切复制机制及与宿主细胞间相互作用，以及如何抑制这种变异株复制，目前尚不清楚^〔1〕。黄病毒感染日益受到人们重视。流行性乙型脑炎病毒作为黄病毒科中成员，成为人们研究黄病毒持续性感染宿主细胞的代表病毒株之一^〔1，2〕。该研究利用人肝癌细胞株KN73建立乙脑病毒体外持续性感染模型，通过病毒滴定方法及核酸测序分析，研究变异株性状与NS3区序列的关系。

　　材料与方法

　　细胞与病毒：人肝癌细胞株KN73，以RPMI 1640加10%胎牛血清进行培养，温度37℃，5%CO₂，每5～7d采用0.25%胰蛋白酶消化技术进行传代。流行性乙型脑炎病毒JaGAr-01株，日本金泽医科大学惠赠。JaGAr-01变异株，为JaGAr-01株在KN73细胞中经持续感染3年所得。

　　病毒滴定方法：采用地鼠肾传代细胞（BHK）空斑试验方法，病毒感染BHK细胞后，以1%胎牛血清加0.6%甲基纤维素的RPMI 1640培养基复盖培养3～4d，1%结晶紫溶液染色，计数空斑数(Plaque-Forming Unit，PFU/ml)。

　　乙脑病毒持续感染模型建立：乙脑病毒野生株感染正常KN73细胞，37℃吸附90min，加培养液在37℃条件下培养至90%细胞出现细胞病变，继续培养残存细胞，待形成单层细胞后进行细胞传代，每传代1次需保存细胞及上清，用于病毒滴定。

　　NS3区测序分析：收集持续感染细胞，参照Sambrook法^〔3〕，进行细胞内RNA提取。采用NS3区特异引物进行RT-PCR，5′-CGG GCA CGT TGT AGG CAT C-3′(sense)与5′-AAC GGA CGG CTT TAG GAC GA-3′(antisense)，RT反应条件：总体积10μl，内含引物(antisense)10μmol/L，dNTP 2mmol/L，逆转录酶0.5U，反应温度及时间为42℃，1h。PCR反应条件：总体积50μl，内含各引物分别为10μmol/L，dNTP 2mmol/L，Taq酶1.5U。反应时间及温度为94℃、2min，64℃、2min，72℃、2min，共39个循环，取样2μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳证实，PCR产物长度约680bp，符合理论长度。参照Sambrook法^〔3〕，从低熔点凝胶中回收PCR产物；选用特异NS3区引物，运用ABI-PRSM^TM310测序系统进行测序分析，方法见试剂盒说明书。此外，流行性乙型脑炎野生株测序方法同上，作为对照。

　　结果

　　1.持续性感染细胞的病毒滴定结果：通过流行性乙型脑炎病毒JaGAr-01感染KN73细胞，该病毒持续性感染模型已经建立，并成功地连续传代3年以上。比较感染早期（感染24～36h）与感染后期（感染3年）细胞培养液及细胞内病毒量变化结果：在早期细胞外培养液中病毒量为10⁶PFU/ml；在后期，在传代后第1日培养液中病毒量为10^3-4PFU/ml，2、3日后迅速降至10PFU/ml以下。另一方面，持续感染细胞内病毒由传代第2～5日一直维持在10^2-3PFU/ml水平（如图1）。

　　2.NS3区测序分析结果：在病毒感染后第40日，可见若干碱基发生变异，并且可稳定持续传代3年，结果如下：位于核苷酸上碱基序列第66位C→U，第72位A→C，第294位U→C，第306位A→G，第342位A→G，另外，尽管上述碱基发生变异，但相应编码的氨基酸如甘氨酸（Val）、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lle)、蛋氨酸(Pro)、谷氨酸(Gly)未发生变异（如图2）。

　　图1　持续感染模型建立过程中培养液及细胞内病毒滴定比较结果

　　Fig 1. Comparison of viral titers of culture fluids in KN73 cells infected with KN73 cells infected during establishment of the model of persistent infection

　　1. Viral titers of culture fluids in KN73 cells infected with JaGAr-01 in the early phase (24～36h) post-infection

　　2. Viral titers of culture fluids in KN73 cells infected with JaGAr-01 in the late phase (3years) post-infection

　　3. Cell-associated viral titers during persistent infection of KN73 cells with JaGAr-01

　　图2　乙脑病毒变异株与野生株NS3区部分序列分析的比较结果

　　Fig 2. Comparison of sequence analysis of NS3 region of mutant JaGAr-01with parent JaGAr-01

　　Up-line P: parent virus，Down-line M: mutant virus (persistently infected virus)， some bases from NS3 region of mutant JaGAr-01 was found change, but amino acids encoded no change

　　讨论

　　关于黄病毒科病毒持续感染的研究，现已有较多报道，具体包括：黄热病(Yellow fever)^〔4〕 、圣路易脑炎(St.Louis encephalitis)^〔5〕 、森林脑炎(Tick-borne encephalitis)^〔6〕 、西尼罗河脑炎(West Nile)^〔7〕 、澳洲墨累溪谷脑炎(Murray Valley encephalitis，MVE)^〔2〕以及流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)病毒等^〔8〕。但目前尚难找到一个较稳定持久感染细胞模型体系用于丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的研究，故针对黄病毒科诸多病毒结构与功能具有相似特点，有必要利用相似的其它同类病毒持续感染模型体系，通过研究其分子生物学特点，推测HCV持续感染的机制为HCV慢性感染的防治开辟新途径。该项研究利用人肝癌细胞建立乙脑病毒持续感染模型，结果显示：持续感染细胞培养液中病毒量为10^3～4PFU/ml（感染早期细胞培养液中病毒量为10⁶PFU/ml），说明从病毒自身性状分析来看，变异病毒的增殖性相应低下，即为病毒变异结果。在实验中，可见到持续感染细胞内病毒基本维持在10^2～3PFU/ml，在细胞传代后1～2日病毒量相对较低（10²PFU/ml），分析原因：在传代初2日，持续感染细胞数量不够，尚未形成单层细胞，故导致胞内病毒量相对较低。另外，在实验中还发现，持续感染细胞传代时，其培养液中病毒量由第1日10³PFU/ml降至第2日10PFU/ml，以及第3日接近消失，分析原因：可能在细胞传代时，胰蛋白酶的消化刺激，使得部分细胞破坏裂解，使得部分持续感染中变异病毒由胞内释出胞外，随着时间推移，病毒迅速裂解，故第2、3日后迅速消失。

　　诸多文献报道，黄病毒科为一类具有相似结构与功能特点的病毒，属单股正链RNA病毒，相对分子质量接近11kb，有一个开放读码框架，三个结构区（C、M、E）和七个非结构区（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5），目前认为NS3区编码蛋白是病毒复制不可缺少的部分^〔9，10〕。从实验结果中观察到，变异病毒株NS3区部分碱基发生变异，但相应编码的氨基酸未发生变化，即属隐性突变。说明变异株与野生株一样，在病毒复制中NS3蛋白起重要作用，也说明蛋白变异不适合病毒持续存在，亦说明，至少变异病毒长期存在原因以及性状改变原因并不是由于NS3蛋白引起，可能是由于其它区域蛋白变异以及病毒蛋白与宿主细胞因子相互作用所致。

　　志谢：本文承日本金江　尺医科大学竹上勉教授悉心指导，在此致谢。

参考文献

　　1，Takegami T, Sakamuro D, FuruRawa T. Japanese encephalitis nonstructural protein NS3 has RNA binding and ATPase activities. Virus Genes, 1994, 9(2):105-112.

　　2，Lancaster MU, Hodgetts SI, Mackenzie JS, et al. Characterization of defective viral RNA produced during persistent infection of vero cells with Murray Valley encephalitis virus. J Virol, 1998, 72(3):2472-2482.

　　3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. Second Edition. Cold Spring Habor Laboratory press, 1989, 345-348.

　　4，Monath TPC. Neutralizing antibody responses in the major immunoglobulin classes to yellow fever 170 vaccination of humans. Am J Epidemiol, 1971, 93:123-129.

　　5，Slavin HB. Persistence of the virus of St. Louis encephalitis in the central nervous system mice for over five months. J Bacteriol, 1943, 46:113-116.

　　6，Fokina GI, Malenko GV, Levina LS, et al. Persistence of tick-borne encephalitis virus in monkeys. V. Virus localization after subcutaneous inoculations. Acta Virol, 1982, 26:369-375.

　　7，Debnath NC, Tiernery R, Sil BK, et al. In vitro homotypic interference by defective interfering particles of West Nile virus. J Gen Virol, 1991, 72:2705-2711.

　　8，Schmaljohn C, Blair CP. Persistent infection of cultured mammalian cells by Japanese encephalitis virus. J Virol, 1977, 24: 580-589.

　　9，Bartholomeusz AI, Wright PJ. Synthesis of dengue virus RNA in vitro: initiation and the involvement of proteins NS3 and NS5. Arch Virol, 1993, 128:111-121.

　　10，Chambers TJ, Weir RC, Grakoui A, et al. Evidence that the N-terminal domain of nonstructural protein NS3 from yellow fever virus is a serine protease responsible for site-specific cleavages in the viral polyprotein. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:8898-8902.

(收稿日期：1999-08-09)