单精子卵细胞浆内注射治疗男性因素不育

江苏医药 2000年第5期第26卷 辅助生育技术

作者：冒韵东　徐珉　刘嘉茵　洪蕾　杨健之　杨乃明　刘翠珍　张炜　殷长军　顾明

单位：冒韵东　徐珉　刘嘉茵　洪蕾　杨健之　杨乃明　刘翠珍（210029　南京医科大学第一附属医院妇产科　江苏省生殖医学重点实验室）；张炜　殷长军　顾明（泌尿外科　江苏省生殖医学重点实验室）

关键词：单精子卵细胞浆内注射；体外受精-胚胎移植；不育，男（雄）性

　　【摘要】　目的　了解单精子卵细胞浆内注射治疗男性因素不育的效果。方法　自1999年7月至1999年11月共进行了11例12周期的单精子卵细胞浆内注射治疗男性因素不育。结果　共取卵细胞149只，成熟卵细胞114只，注射后卵细胞存活率90.35％，正常受精率66.02％，卵裂率98.53％，囊胚获得率26.87％，胚胎移植率83.33％，3例临床妊娠，临床妊娠率25％（每周期）、30％（每次胚胎移植）。结论　应用单精子卵细胞浆内注射(ICSI)治疗严重男性因素不育是男性不育治疗的重大突破。

Intracytoplasmic sperm injection for male factor infertility

MAO Yundong，XU Min，LIU Jiayin

　　（Department of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，The Jiangsu Province Key Lab in Reproductive Medicine，Nanjing，210029）

　　【Abstract】　Objective　To study intracytoplasmic sperm injection for male factor infertility．Methods　We used intracytoplasmic sperm injection（ICSI） for male factor infertility in 12 cycles of 11 couples from July 1999 to Nov．1999．Results　One hundred fourteen matured oocytes from 149 retrieved oocytes were treated by ICSI，and the survival rate was 90.35％．The normal fertilization and cleavage rate were 66.02％ and 98.53％．We got 18 blastocysts from 67 embryos（26.87％） and 10 from 12 patients （83.33％） allowed embryo transfer．The clinical pregnancy achieved in 3 cases and the clinical pregnancy rate was 25％ per cycle or 30％ per embryo transfer．Conclusion　ICSI technique for severe male factor infertility represents a major breakthrough in male factor infertility treatment．

　　【Key words】　　Intracytoplasmic sperm injection　IVF-ET　Infertility，male

　　1992年，比利时的Palermo等报道了世界首例应用单精子卵细胞浆内注射（intracyto plasmic sperm injection，ICSI）技术获得活产^［1］。以后世界许多国家也相继有了成功的报告并肯定了该技术在治疗男性因素不育方面的突破性作用。国内的首例ICSI试管婴儿也已于1996年在广州诞生^［2］。我院在1998年9月获得江苏省首例常规体外受精-胚胎移植（In-vitro fertilization-Embryo transfer，IVF-ET）成功之后，近期又采用ICSI技术获得成功^［3］。本文报道了我院采用ICSI技术治疗男性因素不育的初步研究结果。

　　资料与方法

　　一、病例

　　自1999年7月至1999年11月，我们选择了在本科就诊的11例男性因素或以往常规IVF所有卵细胞均不受精的不育患者。因男方严重少、弱、畸精症或导致不育7例，其中4例精子数＜20×10⁶／ml，活动精子均＜40％或虽＞40％但均为Ⅰ～Ⅱ级运动；另3例精子数虽为（20～30）×10⁶／ml，但活动精子仅15％～20％且均为Ⅰ～Ⅱ级运动。此7例中3例有以往常规IVF时所有卵细胞均不受精病史；输精管堵塞等导致无精、不育2例；非阻塞性无精症2例。所有男性不育患者均行常规染色体检查及Y染色体微缺失（YRRM1，DAZ）检查正常，异常者为避免已发现的遗传缺陷传给后代而暂缓ICSI治疗。女方年龄范围26～39岁（32.5±3.92岁）。男方年龄范围28～41岁（34.58±4.19岁）。

　　二、方法

　　1.控制性促超排卵：采用控制性促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）长方案促超排卵^［3］。

　　2．卵细胞及精液处理：注射hCG后36小时，在B超阴道探头引导下经阴道取卵^［3］。取卵后可将卵置于含10％血清替代补充成分（Serum Substitute Supple-ment，SSS，IRVINE公司）的P1培养液（IRVINE公司）中，在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养2～4小时后，立即在含透明质酸酶（SIGMA公司）的Modified-HTF培养液（IRVINE公司）中，反复吹打，去除卵丘结构（颗粒细胞），洗涤后选择成熟卵细胞（已出现第一极体）行ICSI受精。对于少、弱、畸精症患者，用手淫法取精，阻塞性及非阻塞性无精症患者用经皮附睾穿刺、经皮睾丸穿刺或睾丸活检取精。精液用Isolate（IRVINE公司）梯度离心法、微量Isolate梯度离心法或直接洗涤离心法处理。

　　3．显微操作：应用日本尼康公司TE300型倒置相差显微镜，日本尼康-NARISHIGE显微操作仪。精子注射前在10％PVP（Polyvinylpyrrolidone，IRVINE公司）中制动并充分损伤精子尾部精子膜，然后将制动的精子注入卵细胞浆内，注射后将卵细胞洗涤后移入含10％SSS的P1中，在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。注射后15～18小时检查有无原核出现，2原核者视为正常受精，单原核、3或多原核者视为异常受精，40～60小时后观察卵裂。如正常胚胎数量较少，于取卵后2～3天选择质量优良的4～10细胞胚胎1～4只，用专用胚胎移植管（Cook澳大利亚公司）经阴道行胚胎宫腔内移植。如正常胚胎数量较多（≥8只）且生长良好（生长速度正常，胚胎细胞大小均匀，胞质均匀清晰，碎片少于10％，于取卵后3天换用囊胚培养液（IRVINE公司）培养至取卵后5～6天囊胚期时再行移植。部分胚胎（女方年龄＞35岁）于移植前在Modified-HTF培养液中用Tyrode酸溶液（IRVINE公司）行辅助孵出（Assisted Hatching，AH），即在透明带上“腐蚀”出一个孔以便囊胚由此孵出种植。移植后常规用黄体酮和／或hCG行黄体支持治疗2周。移植后2周行尿妊娠试验及血清hCG检查，7周左右行B超检查有无胎心搏动。

　　结果

　　接受治疗的11例不育患者12周期共取卵细胞149只，最多一次取35只，最少一次取1只，平均12.42±9.25只。成熟卵细胞（出现第一极体）114只，最多25只，最少1只，平均9.50±6.96只，成熟卵细胞比例为76.51％，注射后存活卵细胞数103只，存活率为90.35％（103／114），其中68只卵细胞见到2原核，正常受精率为66.02％（68／103）。10只卵细胞为单原核，3只卵细胞见到3原核。正常受精的卵细胞中67只发生卵裂，卵裂率为98.53％（67／68）。有18只胚胎（3例）培养至囊胚期，囊胚获得率为26.87％（18／67）。2例患者的9只胚胎（7～9细胞胚胎5只，桑椹胚2只及早、中期囊胚1只）在胚胎移植（ET）前行AH。

　　12个治疗周期中10个周期至少有2只胚胎被移植入宫腔，移植率为83.33％（10／12），移植2～5只胚胎的患者分别为2例、4例、3例及1例。胚胎移植总数为33只。3例患者的胚胎已冷冻保存尚未移植。

　　至1999年11月8日，共有3例临床妊娠，临床妊娠率为25％（3／12，每周期），30％（3／10，每ET）。其中单胎1例（囊胚培养），双胎1例（囊胚培养），三胎1例（已成功减去1胎）。无宫外孕。尚无流产发生。

　　讨论

　　一、应用ICSI治疗严重男性因素不育是男性不育治疗的重大突破

　　对于男性不育的治疗，以往曾用内分泌调节，中药甚至常规IVF-ET等，但效果均不佳。本组患者即有3例为以往常规IVF时所有卵细胞均不受精病史。此外，由于抗精子抗体，抗透明带抗体的存在及透明带增厚等原因，在精子质量正常的情况下卵细胞不能受精的现象也较多见，这都是目前常规的IVF-ET技术所难以克服的。

　　以往曾用在透明带上打孔^［4］，透明带部分切除（partial zona dissection，PZD）辅助受精^［5］及透明带下受精^［6］（subzonal insemination，SUZI）等显微受精技术，但这类方法均无法控制多精受精率，且前两者尚需一定的精子数量，加上这三种方法的单精受精率均很低，故一般不被大多数生殖中心所采用。ICSI技术则很好地克服了上述缺点。本研究中，应用ICSI治疗11例严重男性因素不育患者的初步结果，卵细胞存活率、受精率、卵裂率及妊娠率，与国内外常规IVF-ET技术治疗男方精液常规正常的不育患者的结果类似，说明ICSI技术在治疗男性因素不育方面至少达到了常规IVF-ET在治疗女性因素不育的水平，因而此技术已远远优于以往的任何一种治疗男性因素不育的方法。

　　此结果已达到或超过国内外有关实验室在应用ICSI技术初期的结果^［1，2］，尤其是在囊胚获得率AH技术的应用方面。本组所获3例妊娠中有2例应用了囊胚培养技术。因病例数较少，尚无法用统计数据证实该技术在提高妊娠率、胚胎种植率方面的作用，但目前国际上普遍认为此方法有利优质胚胎的选择，提高妊娠率与胚胎种植率^［7］。

　　AH技术是九十年代用于提高年龄＞35岁妇女常规IVF或ICSI后胚胎种植率的方法^［7］，其理论基础为此类妇女的胚胎经体外培养后透明带变厚或硬化，胚胎难以孵出。本组2例患者用此方法虽未获妊娠，但本实验室所做另1例常规IVF-ET＋AH已获妊娠，希望待积累一定病例数后能了解此方法的确切效果。

　　二、ICSI时的正常与异常受精

　　本研究中正常受精率为66.02％，仍有部分卵细胞不能受精或受精异常。受精失败的主要原因是卵细胞无法激活，原因有：（1）卵细胞胞浆不成熟；（2）精子中参与激活卵细胞的因子缺乏或不足；（3）钙离子释放的强度和频率不足以激活卵细胞^［8］。回顾我们的ICSI录像发现，注射精子时对胞浆的回吸不足既对卵细胞刺激不足从而引起钙离子释放不足，又可能造成卵膜未破使精子滞留于胞外。此外注射技术不佳对卵细胞挤压过度，亦可造成细胞骨架损伤。这些原因也可能与受精失败有关。

　　本研究中，单原核卵细胞有10只（9.71％，10／103），此比例高于常规IVF时的单原核出现率，而与其他IVF ICSI报道一致^［2，9］。尽管大多数IVF后的单原核卵细胞都显示已受精^［9］，并完全有进一步发育的能力，但大多数ICSI后的单原核卵细胞都发展成孤雌（受精）分裂^［8，10］。分析原因，一则可能为卵细胞过熟，二则为对卵细胞的处理过程及精子的注射过程，对卵细胞造成的化学或机械刺激，过早激活了卵细胞，未注射精子时已出现第二极体的释出，从而发生“孤雌受精”^［11］。本组10只单原核卵细胞中有9只分裂正常，此结果与上述理论相符。

　　本组共出现3只3原核卵细胞，这是ICSI后次常见的受精异常。李蓉等认为发生原因可以有以下几点：（1）第二次减数分裂纺锤体位于细胞浆皮层内；（2）精子注射过程中，损伤卵细胞浆的骨架结构，但未损伤到纺锤体；（3）卵细胞成熟过程中，纺锤体的位置和方向发生改变^［2］。

　　三、ICSI的安全性问题

　　应用ICSI技术是否会对胚胎发育产生不利影响或有致畸作用，至今尚无确切结论。然而，近年来的ICSI结果应是令人乐观的^［9，10］。

　　不过，随着ICSI技术的出现与迅猛发展，人们开始对其可能带来的遗传危害越来越担忧，因为ICSI本身毕竟是一种侵袭性操作，且又有可能将患有少、弱、畸精和非阻塞性无精症的父亲可能携带的生殖方面的遗传缺陷传给下一代。因此，应对这类患者进行遗传学筛查并提供遗传咨询，采取严格的操作规程，如可能应对高危ICSI夫妇进行种植前遗传学诊断或围产诊断，防止生殖方面的致病基因下传，作到真正的生殖健康。本组男性不育患者在ICSI前均经Y染色体微缺失的检查，正常者再行ICSI治疗就是基于此考虑。

　　参考文献

　　1，Palermo G，Joris H，Devroey P，et al．Pregnancies after intracytopla smic injection of a single sperm atozoon into an oocyte．Lancet，1992，340：17-18．

　　2，李蓉，庄广伦，张敏芳．卵母细胞单精子显微注射治疗男性因素及不明原因不育．中华妇产科杂志，1997，32：211-213．

　　3，刘嘉茵，冒韵东，杨健之，等．体外受精和胚胎移植技术的初步成功．江苏医药，1999，25：847-848．

　　4，Gorden JW，Talansky BE．Assisted fertilization byzona drilling：a mouse model for correction of oligospermia．J Exp Zool，1986，239：347-354．

　　5，Cohen J，Malter H，Fehilly C，et al．Implantation of embryos after partial opening of oocyte zona pellucida to facilitate sperm penetration ［Letter］．Lancet，1988，11：162．

　　6，Ng SC，Bongso TA，Ratnam SS，et al．Pregnancy after transfere of multiple sperm under the zona ［Letter］．Lancet，1988，11：790．

　　7，Meldrum DR，Wisot A，Yee B，et al．Assisted hatching reduces the age-related decline in IVF outcome in women younger than age 43 without increasing miscarriage or monozygotic twinning．J Assist Reprod Genet，1998，15：418-421．

　　8，Flaherty SP，Payne D，Swann NJ，et al．Assessment of fertilization failure and abnormal fertilization after intracytoplasmic sperm injetion （ICSI）．Reprod Fertil Dev，1995，7：197-210．

　　9，Munné S，Tang YX，Grifo J，et al．Origin of single pronucleated human zygotes．J Assist Reprod Genet，1993，10：276-279．

　　10，Cohen J，Levron J，Palermo GD，et al．Atypical activation and fertilization patterm in humans．Theriogenology，1995，43：129-140．

　　11，Edwards RG，Van Steirteghem AC．Intracytoplasmic sperm in jection（ICSI） and human fertilization：does calcium hold the key to success？Hum Reprod，1993，8：988-989．

（收稿：1999-12-14　修回：2000-01-24）