肝细胞肝癌中卵圆细胞的组织学与超微结构研究
临床与实验病理学杂志 2000年第3期第16卷 人体病理学
作者：肖家诚 朱延波 朱上林 李勤裕 Ruck P Adam A Kaiserling E
单位：肖家诚 朱延波（上海第二医科大学附属瑞金医院 病理科）；朱上林 李勤裕（外科 200025） ；Ruck P Adam A Kaiserling E（德国Tübingen 大学病理所， 72076 Tübingen）
关键词：肝肿瘤；卵圆细胞； 白蛋白； cytokeratin 7； 显微镜检查，免疫电子
摘要 目的：探讨人肝癌肝组织存在卵圆细胞的可能性。方法：对20例人肝细胞肝癌的手术标本行常规组织学和超微结构观察，并用胆管上皮分化标记CK7和肝细胞分化标记白蛋白对以上组织作免疫组化染色，同时对其中5例作免疫电镜标记。结果：光镜下，14/20例癌肿边缘常可见到增生的小胆管样结构。电镜下，14/20例可找到三型卵圆细胞。其中Ⅰ型细胞体积较小、核大、胞质少，此为较为原始的卵圆细胞。Ⅱ型细胞体积稍大，胞质稍多，此为向胆管上皮分化的小上皮细胞。Ⅲ型细胞体积稍大，内含稍多粗面内质网，此为向肝细胞分化的卵圆细胞。此三型卵圆细胞均有细胞内张力微丝和细胞间连接结构。免疫电镜显示，三型卵圆细胞均表达CK7 和白蛋白, 但Ⅰ型和Ⅱ型表达CK7多些，Ⅲ型表达白蛋白多些。结论：与动物致癌模型肝中存在卵圆细胞一样，人肝细胞肝癌肝中也存在同样形态和免疫表型特点的卵圆细胞。结果支持卵圆细胞可能为肝前体细胞的假设。
中图分类号 R735.7 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)03-0177-03
Oval cells in hepatocellular carcinoma: a histological and ultrastructural study
Xiao Jiacheng
（Dept of Pathol）
Zhu Yanbo
（Dept of Pathol）
Zhu Shanglin
（Dept of Surg, Ruijin Hospital of Second Medical University Shanghai, Shanghai 200025）
Li Qinyu
（Dept of Surg, Ruijin Hospital of Second Medical University Shanghai, Shanghai 200025）
Ruck P
（Institute of Pathology of University Tübingen, 72076 Tübingen, Germany）
Adam A,
（Institute of Pathology of University Tübingen, 72076 Tübingen, Germany）
Kaiserling E
（Institute of Pathology of University Tübingen, 72076 Tübingen, Germany）
ABSTRACT Purpose To investigate whether the oval cells exist in human hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Surgical specimens from 20 cases of human HCC were investigated by light microscopy, electron microscopy, and immunostaining for cytokeratin 7 (a marker of biliary differentiation), and albumin (a marker of hepatocytic differentiation). Double-labeling for these two antigens was carried out by immunoelectron microscopy in 5 cases. Results Proliferating bile ductules were noted around the edges of tumors in 14 of 20 cases. Electron microscopy revealed three types of oval cells. Type Ⅰ cells were small, primitive oval cells with a high nucleocytoplasmic ratio. Type Ⅱ cells, which exhibited differentiation towards biliary epithelial cells, were larger and exhibited more cytoplasm. Type Ⅲ cells exhibited similarities with hepatocytes,which were larger and contained more rough endoplasmic reticulum. Intracellular tonofilaments and intercellular junctions were seen in all three types of oval cells. By immunoelectron microscopy all three types of oval cells were found to express cytokeratin 7 and albumin, although labeling for cytokeratin 7 was stronger in types Ⅰ and Ⅱ, and labeling for albumin was stronger in type Ⅲ. Conclusion Oval cells that exhibit the same morphologic and immunophenotypic features as those seen during animal hepatocarcinogenesis are found in human HCC. The findings support the hypothesis that oval cells are hepatic progenitor cells.
KEY WORDS liver neoplasms; oval cells; albumin; cytokeratin 7; microscopy，immunoelectron
人肝组织是否存在具有向胆道上皮细胞分化和肝细胞分化能力的卵圆细胞，至今报道不多〔1〕。最近我们在人肝母细胞瘤和胆道闭锁的肝组织中发现一类小上皮细胞(SEC), SEC表现了动物致癌肝中卵圆细胞的形态学和免疫表型特点〔2～5〕。同期我们还初步观察到人肝细胞肝癌肝组织中也有类似的SEC〔6,7〕。为了探讨人肝细胞肝癌组织中也存在卵圆细胞，作者对20例人肝细胞肝癌进行观察。
1 材料与方法
对来自本院外科手术切除的20例肝细胞肝癌标本进行光镜、免疫组化和透射电镜观察，5例做了免疫电镜观察。
对做光镜和免疫组化观察的标本，组织固定于PBS缓冲的10％福尔马林中，用石蜡包埋。免疫组化用ABC法，标记用多克隆兔抗人白蛋白(albumin,1∶1 000)抗体和鼠抗人CK7（1∶100）抗体(均为Dako公司产品)，以DAB作染色源。CK7抗体孵育前，切片经微波处理。白蛋白抗体孵育前，切片则先用蛋白酶消化处理。
对做常规透射电镜观察的标本，组织固定于4％戊二醛中，用环氧树脂Epon 618包埋。电镜下着重观察癌周组织增生的胆小管组织或小细胞。
对做免疫电镜观察的标本，组织固定于3％多聚甲醛＋0.1%戊二醛中2 h（4℃）后在 -20℃中用K4M包埋。免疫标记在超薄切片上完成，并分别采用多克隆兔抗人白蛋白(1∶1 000)抗体和鼠抗人CK7抗体单独（单标记）或同时（双标记）孵育，二抗采用5 nm金标记的羊抗兔IgG和15 nm金标记的羊抗鼠IgG。具体方法见文献〔8〕。
2 结果
光镜下，14/20例中肝癌巢团周边常可见到增生的小胆管样结构或成簇的或散在分布的卵圆细胞。这种增生的小胆管样结构多为4～8个细胞排列而成，其中有些细胞与周围分布的卵圆细胞大小形态相似，均表现为圆或卵圆形，胞核大而胞浆少（图1A）。
免疫组化结果显示，肝癌周边这种增生的小胆管样结构内有少数细胞或癌周部分增生的卵圆细胞，既表达胆管上皮细胞分化的标记CK7，又表达肝细胞分化的标记白蛋白（图1B, 1C）。
常规透射电镜观察，我们发现在肝癌巢团周边，增生的卵圆细胞多数组成小胆管样结构。在电镜下有14/20例可找到与我们在人肝母细胞瘤、胆道闭锁肝中所见的三型SEC，我们称之为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型卵圆细胞。电镜下，其中Ⅰ型卵圆细胞体积小，约7～12 μm，胞核大，胞浆相对较少，核质比高，核仁常较明显，胞质内主要为游离核糖体，仅偶见粗面内质网和线粒体，胞质内明显可见散在的张力微丝束，此外可见它与周边细胞的细胞间连接结构（图2A）。Ⅱ型卵圆细胞较Ⅰ型体积略大，约在10～15 μm之间，与肝细胞，胆管上皮细胞相比，其胞质仍很少，核质比高。胞质内含稍多的糖原及一定量的粗面内质网和线粒体，也有少量胞质内张力微丝结构（图2B）。Ⅲ型细胞体积也比Ⅰ型细胞体积稍大，胞质稍多，与Ⅱ型细胞相比，其内含有更多量的粗面内质网和线粒体，较少量的胞质内张力微丝结构（图2C）。此三型卵圆细胞均有细胞间连接结构。
免疫电镜结果表明，三型卵圆细胞均既表达CK7，又表达白蛋白, CK7的表达主要集中在卵圆细胞胞质内的张力微丝束内, 白蛋白的表达则弥散分布于这类细胞的胞质中（图2D）。这种免疫表型的表达又表现出了细胞分化程度的差异。如Ⅰ型卵圆细胞分化最不成熟，其内有一定的张力微丝，表达CK7较明显, 白蛋白表达很弱, Ⅱ型卵圆细胞具有向胆管上皮分化的形态，内主要含较多量胞质内张力微丝结构，表达CK7较明显, 白蛋白表达较弱, Ⅲ型卵圆细胞表现出向肝细胞分化的倾向，则其胞质内表达白蛋白较为显著， 而 CK7表达较少。
3 讨论
肝组织中是否存在如骨髓一样具有多种分化潜能的干细胞，一直存在争论。80年代以来，一些作者发现大鼠实验性肝癌组织中存在具有向肝细胞和胆管细胞双向分化潜能的卵圆细胞，人们推测这是肝脏的干细胞或肝前体细胞。 免疫组化结果证实，这种卵圆细胞既有胆道上皮标记的表达，又有肝细胞标记的表达，近年来越来越多的动物实验报道这种肝前体细胞的存在〔9～12〕。
| 图1 肝细胞肝癌。肿瘤边缘及肿瘤间大量小圆细胞(A)，这些细胞 CK 7 染色阳性(B)，白蛋白染色阳性(C)。A.HE×100, B. 抗CK7染色,×100, C. 抗白蛋白染色, ×100 |
图2 肝细胞肝癌。电镜下Ⅰ型卵圆细胞(A)，Ⅱ型卵圆细胞(B)和Ⅲ型卵圆细胞(C)，免疫电镜显示(D)，卵圆细胞内散在抗白蛋白胶体金(大颗粒)及张力微丝内有抗 CK 7 胶体金颗粒(小颗粒)。A、 B、C×8 000, D. ×40 000
最近我们在人肝母细胞瘤和胆道闭锁肝中发现有类似大鼠肝癌组织中的卵圆细胞。与动物实验肝组织中的卵圆细胞相似，这类细胞既表达胆道上皮的标记，又表达肝细胞的标记〔2～5〕。
笔者通过对人肝癌肝组织的进一步研究，发现在人肝癌肝组织同样存在与大鼠肝癌相似的卵圆细胞，这种细胞与我们在人肝母细胞瘤和胆道闭锁肝中发现的SEC，与Desmet等〔1〕和Novikoff等〔12〕所描述的上皮细胞或卵圆细胞形态都大致相同。研究还表明，卵圆细胞表现出不同程度分化的形态学与免疫表型特点，如胞浆内张力微丝由多到少，CK表达由多到少，随着胞浆内细胞器的增多，白蛋白的表达逐渐增多等。其中Ⅰ型细胞分化最不成熟，表现为较为原始的卵圆细胞，Ⅱ型细胞表现为向胆管上皮分化，Ⅲ型细胞则为向肝细胞分化的卵圆细胞。这些均与我们在人肝母细胞瘤和胆道闭锁肝中发现的SEC形态和免疫表型分化特征基本相似。
本研究再次证实，人类肝肿瘤(肝母细胞瘤、肝细胞肝癌)中也存在卵圆细胞，结合人胆道闭锁肝中也发现有此类卵圆细胞，因此，人类肿瘤性肝和非肿瘤性肝组织中均已发现卵圆细胞，人类肝组织同样可能存在着干细胞或肝前体细胞。
基金项目:国家自然科学基金(No 39870772)、国家教委科研基金、上海市教委科研基金(No 98BJ03)资助项目
作者简介：肖家诚，男，48岁，德国医学博士，副教授。研究方向：人肝组织干细胞
参考文献
1，De Vos R, Desmet V. Ultrastructural characteristics of novel epithelial cell types identified in human pathologic liver specimens with chronic ductular reaction. Am J Pathol, 1992; 140:1441～1450
2，Ruck P, Xiao JC, Kaiserling E. Small epithelial cells and the histogenesis of hepatoblastoma. Electron microscopic, immunoelectron microscopic, and immunohistochemical findings. Am J Pathol, 1996; 148: 321～329
3，Ruck P, Xiao JC, Kaiserling E et al. Hepatic stem-like cells in hepatoblastoma: expression of cytokeratin 7, albumin and oval cell associated antigens detected by OV-1 and OV-6. Histopathology, 1997; 31:324～329
4，Xiao JC, Ruck P, Kaiserling E. Ductular differentiation in hepatoblastoma. Pathol Res Pract, 1997; 193:119
5，Xiao JC, Ruck P, Kaiserling E. Small epithelial cells in extrahepatic biliary atresia. Electron microscopic and immunoelectron microscopic findings suggest a close relationship to liver progenotor cells. Histopathology, 1999; 35:454～460
6，Xiao JC, Ruck P, Kaiserling E. Small epithelial cells and the histogenesis of hepatocellular carcinoma. morphological, immunohistochemical and electron microscopical findings. Pathol Res Pract, 1996; 192:343
7，Xiao JC, Ruck P, Kaiserling E. Zur Bedeutung der kleinen epithelien Zellen beim hepatozellulren Karzinom. Immunohistochemische, electronenmikroskopische und immunelektronenmikroskopische Befunde. Verh Dtsch Ges Pathol, 1996; 80:407
8，Xiao JC, Adam A, Kaiserling E et al. Heat mediated antigen retrieval in electron microscopical immunocytochemistry. Biotech Histochem, 1996; 12:202～208
9，Sell S. Is there a liver stem cell? Cancer Res, 1990; 50:3811～3815
10，Gerber MA, Thung SN. Liver stem cells and development. Lab Invest, 1993;68:253～254
11，Thorgeirsson SS. Hepatic stem cells. Am J Pathol, 1993; 142: 1331～1333
12，Novikoff PM, Ikeda T, Hixson DC et al. Characterizations of and interactions between bile ductule cells and hepatocytes in early stages of rat hepatocarcinogenesis induced by ethionine. Am J Pathol, 1991; 139:1351～1368
收稿日期：1999-11-22
修回日期：2000-02-17
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