人肝癌组织中CD34和血管内皮生长因子的表达及微血管密度的病理意义

　　中华病理学杂志2000年第29卷第4期

马捷　周晓军　张泰和　孙桂勤　孟奎

　　摘　要　目的　探讨CD34和血管内皮生长因子(VEGF)在人肝癌组织中的表达及微血管密度（MVD）的病理意义。方法　对30例人肝细胞肝癌(HCC)及相应癌旁组织，10例肝硬化，5例轻度慢性肝炎和4例正常肝组织，进行了CD34、VEGF免疫组织化学SP法检测，对CD34阳性血管进行MVD计数，对VEGF进行半定量计数，并结合肝癌的病理特征进行分析。结果　HCC组织中CD34呈广泛，窦隙状阳性表达，而在正常及慢性肝炎组织中肝窦呈阴性，在纤维间隔附近的肝窦壁可见少量散在的CD34弱阳性表达，MVD与HCC的肿瘤大小及是否发生门静脉癌栓密切相关，瘤块直径＜2 cm者的MVD显著低于＞2 cm者，VEGF阳性率为83.3%（25/30），而在5例慢性肝炎患者中为阴性表达，并与肿瘤发生门静脉癌栓关系密切（P＜0.05）。瘤旁肝组织亦显示较明显的VEGF阳性（93.3%，28/30）。结论　CD34和VEGF的阳性表达为HCC与非癌性肝组织的鉴别诊断提供了较为可靠的形态学标记。瘤组织可通过自分泌和旁分泌的VEGF促进肿瘤血管形成。

　　关键词：肝肿瘤；新生血管化，病理性；内皮生长因子；抗原，CD34；诊断，鉴别

　　肝癌的形成及术后复发、转移机制一直是研究的热点之一，但至今尚未充分阐明。肝病研究者们都试图寻找能预示肝癌预后的良好指标。血管生成在肿瘤的生长和转移中起着重要作用。实验模型提示诱导血管生成的能力在肿瘤发生的早期即表现出来，是肿瘤的一种固有的生物属性^［1，2］。对乳腺癌、肺癌、前列腺癌等实体性肿瘤的研究表明，肿瘤的血管生成与肿瘤的病理进展和预后不良密切相关。CD34为血管内皮细胞的特异性标记，但在正常肝窦中CD34呈阴性。新近报道显示,CD34显示血管内皮细胞时,其特异性最高,优于内皮细胞的其他标记物^［3］。我们用抗CD34单克隆抗体显示血管内皮细胞，探测人肝细胞肝癌(HCC)中CD34和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达以及微血管密度（MVD)，并与相应癌旁组织、肝硬化、轻度慢性肝炎及正常肝组织作对照，结合临床资料分析其病理意义。

　　材料与方法

　　1.材料：30例HCC及相应癌旁组织均为我院近5年来的外检手术切除存档蜡块，经病理证实为HCC，组织均经4%甲醛固定,常规石蜡包埋，厚4μm连续切片，分别作HE和免疫组织化学染色。10例肝硬化、5例轻度慢性肝炎和4例源于尸检的正常肝组织作为对照观察。

　　2.临床资料：30例HCC中，男性24例，女性6例，年龄33～69岁，中位年龄48岁。血清HBsAg23例阳性，其中1例为输血后丙型肝炎与乙型肝炎重叠感染；7例经血清学乙型肝炎二对半及丙型肝炎病毒抗体检测均为阴性。

　　3.病理资料：30例HCC中，24例为单结节；4例为巨块型，有卫星灶；2例为弥漫结节型。瘤结节直径1～10 cm，其中直径＜5 cm小肝癌6例。肿块切面灰白色，质地较硬。23例切面有不同程度的坏死，6例门静脉有癌栓形成，其中2例伴有肝外转移。肿瘤病理分级按WHO标准分为，高分化(G1级)17例，中分化(G2级)8例，低分化(G3级)5例。

　　4.方法：30例HCC及相应癌旁组织，10例肝硬化，5例轻度慢性肝炎及4例正常肝组织均行CD34、VEGF(均为单抗，美国Zymed公司产品)免疫组织化学染色。染色方法按链霉素抗生物素蛋白－过氧化物(SP法)试剂盒说明书步骤进行，微波预处理，微波抗原修复液为pH6.0柠檬酸缓冲液，具体操作同我室以往的报道^［4］，经DAB显色后，苏木素复染，中性树胶封片。以正常一抗动物血清和缓冲液代替一抗作阴性对照。

　　5.结果判定：CD34阳性标准按Weidner等^［5］方法。MVD计数:肝窦内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞族代表1条单独的微血管。按照Weidner等^［5］方法并加以改进，先在低倍视野内(40×、100×)找到肿瘤组织内微血管密度最高的区域，然后在高倍视野内(400×)计数微血管的数目。分辨不清或染色模糊的细胞不计入计数结果。2名病理医生采用双盲法分别对同一切片计数，取两者计数中较高的数据作为该切片的MVD。VEGF的染色结果参照Chow等的标准^［6］，由2名病理医生采用双盲法(独立检测)，瘤细胞中阳性＜5%为+，5%～15%为++，＞15%为+++。

　　6.统计学分析：定量资料：两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用方差分析；多组的两两间比较采用Newman-Keuls检验。半定量资料：两组间比较采用Mann-Whitney秩和检验；多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，多组的两两间比较采用Dunn检验。

　　结果

　　一、光镜检查

　　30例HCC中，25例呈梁索型，癌细胞排列成梁状或窦隙状结构；5例呈腺样型，癌细胞排列成假腺样及腺泡状结构，其中6例癌组织部分区域见成片的透明细胞。癌旁组织24例伴有肝硬化，6例未见肝硬化病变，但汇管区均见有较多的淋巴细胞浸润。

　　二、免疫组织化学结果

　　1．CD34表达及MVD与肝癌临床病理特征的关系：CD34在4例正常肝组织中肝窦处均未见阳性表达，在HCC癌细胞呈棕黄色至棕褐色(图1)窦隙状弥漫分布，而癌旁肝组织则呈阴性。5例轻度慢性肝炎肝窦均为阴性，肝硬化组织中除汇管区和纤维间隔中有CD34阳性的小血管外，伴有明显炎细胞浸润的纤维间隔周边的肝窦内可见少量散在的CD34淡黄色阳性表达。此外，在直径＞1 cm的巨大再生结节(Macro regenerative nodule,MRN)中，有异型增生的肝细胞窦壁亦可见CD34弱阳性表达。MVD与HCC患者的临床和病理特征的关系见表1，经统计学分析，MVD与瘤组织发生门静脉癌栓密切相关(P＜0.05)，并与肿瘤大小有关，直径＜2 cm组与直径2～5 cm组MVD差异有显著性意义(P＜0.05)，MVD与患者的年龄、性别、肿瘤组织学分级等的相关性无显著意义。

表1　30例HCC组织MVD与VEGF表达及其与临床病理特征之间的关系

　　注：^*与肿瘤直径＜2 cm组比较，P＜0.05，^△与有门静脉癌栓组比较，P＜0.05

图1　HCC癌组织内CD34阳性弥漫、窦隙状的表达　SP法×200

　　2．VEGF在HCC及非癌性肝组织的表达：VEGF在正常肝组织肝细胞无表达，在HCC中的阳性率为83.3%（25/30），阳性定位于癌细胞胞质，呈灶性分布(图2)。30例HCC中，VEGF阳性分别为4例(+++)，5例(++)，16例(+)，5例为阴性。HCC中VEGF表达与患者临床病理特征之间的关系见表1。经统计学分析显示，VEGF的表达与HCC瘤组织发生门静脉癌栓密切相关，与患者的年龄、性别、肿瘤大小及组织学分级的相关性无显著性意义。除HCC癌细胞表达VEGF外，癌旁肝组织亦呈VEGF阳性。阳性主要出现在汇管区或纤维间隔周边区域的肝细胞内，分别为5例（+++)、6例(++)、17例(+)、2例阴性，阳性率为93.3%（28/30）。另外，6例肝硬化及1例轻度慢性肝炎亦见弱阳性VEGF表达，两组与HCC组相比，差异均有显著性意义(P＜0.05)。

图2　HCC癌组织内VEGF呈灶性阳性　SP法×400

　　讨论

　　近年来，关于血管生成与肿瘤的关系引起了广大学者的高度重视。有报道，实体性肿瘤直径大于2 mm时，其进一步的发展必须依赖于血管生成，这些新生的血管网络系统为肿瘤的生长提供充分的氧和养料，保证了肿瘤细胞的快速增殖能力^［1］。肿瘤生长依赖于血管生成的观点已得到大量研究结果的证实^{［1，2，7］}。血管增生的程度可以反应肿瘤诱导血管生成的能力^{［5，8-10］}，从而在一定程度上反应着肿瘤的生物学行为。

　　我们采用抗CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞，结果显示正常肝组织的窦内皮细胞无CD34表达，而肝癌组织内显示弥漫的CD34强阳性表达，呈棕黄色或棕褐色窦隙状分布，在癌旁肝组织、肝硬化及轻度慢性肝炎组肝实质内多为阴性，阳性主要见于汇管区及纤维间隔内的血管壁，在纤维间隔向肝实质内伸展区周围肝组织内可见少量散在的CD34弱阳性表达。有文献报道，HCC的最初阶段无窦周毛细血管化，随着瘤体长大，窦周毛细血管从HCC中央部位开始发生，在这一时期中CD34的表达差异最大，可呈阴性、局灶或弥漫分布^［11］。进入血管期的HCC则显示弥漫、均匀的毛细血管化。本研究结果中CD34的表达与文献报道^［3，11］基本一致，显示CD34可作为鉴别肝癌组织与非癌性肝组织的较为有用的指标，与我们以往的研究结果^［12］相似。

　　Weidner等报道^［8］，新生血管系统在肿瘤内的分布是不均衡的，检测微血管密度应该选择肿瘤新生血管最密集的区域(即“热岛”)，并认为诱导血管生成的能力较高的细胞其增殖力也较强，细胞间的接触性抑制也较低，因此是产生转移灶的基地。我们用双盲法对人体肝癌中MVD的测定显示，MVD在肿瘤直径＜2 cm者较＞2 cm者差异有显著性意义，并与瘤组织发生门静脉癌栓密切相关。

　　HCC的诊断性血管造影依赖于HCC的血管密度，文献报道，其敏感性与肿瘤的大小有关，肿瘤直径＜1 cm者不敏感，直径3～5 cm者敏感性为82%～89%，直径＞5 cm者敏感性为100%^{［13，14］}。我们的研究显示，MVD与肿瘤大小有关，瘤体直径＜2 cm者与＞2 cm者相比差异有显著性意义，为临床诊断性血管造影提供了形态学依据。

　　新生血管是以血管生成因子为中介诱导产生的。VEGF作为一种重要的血管生成因子，在多种疾病的基础与临床研究中正受到越来越多的重视。VEGF是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，其两种受体，即Flt-1和KDR/Flk-1仅存在于血管内皮细胞，因此，VEGF对于血管内皮细胞有高度的特异性^{［10，15］}。本研究显示，VEGF在正常肝细胞内无阳性表达，83.3%HCC细胞显示VEGF阳性，表明瘤细胞可通过自分泌途径促进瘤组织内微血管的生成，VEGF的表达与瘤组织发生门静脉癌栓和转移密切相关，HCC细胞的VEGF的表达与MVD具有相关性，为临床进行肝癌的抗血管生成治疗这一新途径提供了理论依据。

　　我们在对30例HCC及相应癌旁组织的观察中发现，除瘤细胞表达VEGF外，癌旁肝组织亦显示较明显的VEGF阳性表达，提示癌组织可通过自分泌和旁分泌两种途径共同促进瘤组织内的微血管形成，HCC组VEGF表达较肝硬化组及轻度慢性肝炎组明显提高，与文献报道的HCC循环血中的VEGF水平增高^［16］一致。表明HCC患者VEGF表达增加，参与诱导瘤组织内窦壁毛细血管化及CD34的表达，促进肝癌的病程进展。

　　作者单位：马捷（210002南京，南京军区南京总医院病理科)

　　周晓军（210002 南京，南京军区南京总医院病理科)

　　张泰和（210002 南京，南京军区南京总医院病理科)

　　孙桂勤（210002 南京，南京军区南京总医院病理科)

　　孟奎（210002 南京，南京军区南京总医院病理科）

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