抗肝癌NMP单克隆抗体的制备及初步鉴定
免疫学杂志 1999年第1期第0卷 临床免疫学
作者：黄俊琪1 张昌卿２ 区深明2 刘乐和1
单位：黄俊琪 刘乐和 中山医科大学微生物学教研室 广州 510089； 张昌卿 区深明 中山医科大学附属肿瘤医院
关键词：肝癌 核基质 单克隆抗体
摘 要 为制备出具较高特异性抗肝癌核基质蛋白单克隆抗体，以用于肝癌的基础和临床的研究。首次免疫用肝癌细胞纯核，用高盐抽提法提取的肝癌细胞核基质蛋白加强免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，ELISA法同时测定培养上清对肝癌核基质蛋白及正常肝细胞核基质蛋白的免疫反应，LSAB法进行单抗的鉴定。结果：建立了一株能稳定分泌抗肝癌核基质蛋白单抗的杂交瘤细胞株2G8，染色体数目为86－92，Ig亚类鉴定为IgM，它与HBsAg、HBeAg等HBV相关抗原无交叉反应，与AFP亦无阳性反应，LSAB法证实单抗定位于肝癌细胞核上，与正常肝及胎肝细胞没有交叉反应，与4种癌症细胞和3种正常细胞的反应发现仅食管癌细胞核上有较弱的阳性反应。结论：获得一株较特异的抗肝癌核基质蛋白单抗，可望进一步用于肝癌的诊断治疗及肝癌发生发展的研究。
中图号 R392.11
PREPARATION AND PRELIMINARY IDENTIFICATION OF
MONOCLONAL ANTIBODY（McAb）TO NUCLEAR MATRIX
PROTEIN（NMP） OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA （HCC）
Huang Junqi，Zhang Changqing，Ou Shenming，Liu Lehe
（Department of Microbiology，Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089）
Abstract To establish hybridomas which produce monoclonal antibody（McAb）to nuclear matrix proteins（NMPs）of HCC．NMPs of HCC were extracted with high salt extraction to immunize Balb／c mouse．Hybridomas were selected with enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）．Specificity of McAb was tested by LSAB technique．Results showed that hybridoma 2G8 which could produce stably anti-NMP of HCC McAb were established．The chromosomes of 2G8 cells were from 86 to 92．McAb 2G8 was found to be of the IgM was isotype by double diffusion and was located on HCC cells nuclei showed by LSAB technique．McAb 2G8 did not react with normal human liver cells、embryonic liver cells、other three normal cells and three tumor cells．There was only weak positive reaction on the nuclei of esophagus cancer cells，Our results suggest that McAb 2G8 could be specific McAb to NMP of HCC，and it might be used in basic and clinical researches of HCC with a bright prospect．
Key words Nuclear matrix，Monoclonal antibody，Hepatocellular carcinoma（HCC）
核基质（Nuclear Matrix，NM）是近十几年来在细胞生物学和肿瘤生物学中研究得十分活跃的领域。它作为真核细胞核内染色质的网架结构有着极其重要的生理功能［1～4］。它与肿瘤的发生密切相关，研究表明肿瘤细胞对应其正常细胞存在特异性核基质蛋白（Nuclear Matrix Protein，NMP）。［5］国外已制备出结肠癌、乳腺癌等肿瘤特异性NMP 单克隆抗体（Monoclonal Antibodies，McAbs），特异性较好，有一定的应用前景和研究价值。［6］但目前国外关于肝癌NMP McAb的报道较少，国内尚未见报道。本课题应用高盐抽提法提取人肝癌NMP，改进免疫方法，克隆出一株能稳定分泌抗肝癌NMP McAb的杂交瘤细胞株，并对其所分泌的McAb作了初步的鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞：肝癌细胞Bel-7402、鼻咽癌SUNE细胞由本校肿瘤研究所惠赠；SP2／0-Ag14由本教研室冻存复苏；正常人血管内皮细胞、正常脐带血淋巴细胞由由本室制备；白血病细胞K562由本校附属第一医院血液内科提供；胃癌细胞803、正常人成纤维细胞由本校生化教研室提供；食管癌细胞EC-8712来源于汕头大学医学院生化教研室。
1.1.2 组织：肝癌组织是本校肿瘤医院提供的手术切除的新鲜标本，经病理检查证实为肝细胞型肝癌。保存在－40°C备用。正常肝组织由本校病理教研室提供。胎肝组织由广州市妇婴医院提供。
1.1.3 实验动物：雌性8周龄Balb／c鼠由本校动物中心提供。
1.1.4 试剂：HT、HAT、抗小鼠免疫球蛋白（亚类）抗体及辣根过氧化物酶标抗体皆为SIGMA公司产品，LSAB试剂盒为DAKO公司产品。
1.2 方法
1.2.1 NMP的提取：肝癌、正常肝、胎肝组织NMP的提取按文献［7］进行并稍加改动，用非离子去污剂及高盐提取液进行处理。紫外分光光度法测定NMP蛋白含量。
1.2.2 肝癌细胞纯核的制备：细胞悬液经去污剂处理后，取少许用1％甲基兰染色镜检，细胞核几乎完全游离出来，用含0.5ml蔗糖的缓冲液垫底，800g离心10min，PBS悬浮，紫外分光光度法测蛋白含量。
1.2.3 SDS-PAGE法分析肝癌NMP及纯核组分。
1.2.4 免疫Balb／c小鼠脾细胞的制备：共免疫3次，每次间隔2周，首次免疫用福氏完全佐剂与肝癌细胞纯核混合物0.1ml（纯核蛋白的总浓度为15μg）腹腔注射，以后免疫用肝癌NMP PBS液0.1ml（含肝癌NMP 100μg）。融合前3d腹腔注射肝癌核基质100μg加强免疫。融合时无菌取其脾细胞备用，细胞活力100％。
1.2.5 鼠骨髓瘤细胞准备：选择HAT敏感的SP2／0细胞，活力要求100％。
1.2.6 杂交瘤细胞的建立：免疫脾细胞与骨髓瘤SP2／0细胞以4∶1比例在50％PEG 4000作用下融合，用含HAT的RPMI 1640培养液培养于96孔板中，当杂交瘤长满1／3时，取上清液用间接ELISA的方法进行筛选，同时检测上清对肝癌NMP及正常肝细胞NMP的反应性，选择对肝癌NMP呈强阳性反应而对正常肝细胞NMP无反应的细胞用有限稀释法进行克隆。
1.2.7 单抗的大量制备：单克隆化的杂交瘤细胞体外大量增殖，收集上清。或将杂交瘤细胞注入Balb／c小鼠的腹腔，10～15d后抽取腹水，－20°C保存备用。
1.2.8 抗原片的制备：按文献［8］制做各种癌症细胞和正常细胞片备用。
1.2.9 杂交瘤细胞染色体数目分析。
1.2.10 单抗Ig分类：用琼脂双扩散法检测
1.2.11 单抗效价滴定试验：用ELISA方法检测培养上清和腹水中单抗的效价。
1.2.12 单抗特异性的初步鉴定
1.2.12.1 用ELISA法检测单抗与HBsAg、HBeAg、AFP的免疫反应性。
1.2.12.2 用免疫组化LSAB法检测单抗在肝癌细胞上的定位以及在各种细胞片及组织冰冻切片上的反应。步骤参照LSAB试剂盒说明书，将细胞片及组织冰冻切片用PBS洗2次，1％BSA封闭20min，加入不同稀释度单抗2G8 50μl，4°C冰箱过夜；PBS洗3次，加入50μl生物素标记马抗鼠IgG（1∶250），37°C 60min；PBS洗3次，加入50μl链霉菌素卵白素（1∶200），37°C 30min；PBS洗3次，0.04％DAB＋0.03％H2O2室温下显色、水洗、脱水、透明、封片。阴性对照一抗用PBS代替McAb 2G8。
2 结果
2.1 肝癌细胞核的制备 肝癌细胞经去污剂处理后用1％甲基兰染色，镜下可见细胞核游离出来，形成裸核（见图1），裸核有聚集成团的特性。
| 图1 经去污剂处理甲基兰染色后肝癌Bel-7402细胞的裸核
Fig 1 Nude nuclei of Bel-7402 cell homogenated with detersive and stained with 0．1％ methylene bule（400×）
2.2 SDS-PAGE法分析肝癌NMP及核组分 发现肝癌NMP组分较多，在40KD～67KD之间有几条主带，这与国内外关于NMP的报道相符，而肝癌细胞核除了具有NMP的组分以外，分子量在17.5KD以下有两条浓染带（见图2）。 |
图2 SDS-PAGE法比较肝癌裸核与肝癌NMP
Fig 2 Comparison of nude nuclei and NMP of HCC liver cells by SDS-PAGE
M：marker
1～3：NMP of HCC liver cells
4～6：nude nuclei of HCC liver nuclei
2.3 杂交瘤细胞的筛选及克隆化 经ELISA法筛选，发现其中15孔的杂交瘤细胞上清对肝癌NMP呈强阳性反应，同时对正常肝细胞NMP呈阴性反应，二次克隆化后有5株细胞抗体分泌阳性率100％，经LSAB法鉴定有一株定位于肝癌细胞核上，将其命名为2G8。
2.4 杂交瘤细胞稳定性及分泌活性鉴定 2G8经4次以上克隆，连续传代6个月，在液氮中冻存3个月复苏后仍能稳定地分泌单抗。
2.5 McAb滴度测定 ELISA法测2G8细胞培养上清和制备的小鼠腹水其效价分别为1∶160和1∶25 600。
2.6 McAb类型及亚型的鉴定 单抗重链为IgM，轻链为k型。
2.7 染色体分析 2G8细胞染色体数目平均为89±3。证实确为杂交瘤细胞。
2.8 McAb 2G8特异性的初步鉴定
2.8.1 ELISA法发现McAb与HBsAg、HBeAg等HBV相关抗原无交叉反应，与AFP也无反应。
2.8.2 LSAB法测定McAb在肝癌细胞上的定位发现McAb定位在肝瘤细胞的核上（见图3～8）。图3、图5可见McAb在肝癌细胞Bel-7402核上有棕色阳性反应（图5用甲基绿进行复染）；图4、图6为图3、图5的阴性对照；图7可见McAb在肝癌组织冰冻切片核反应阳性；图8可见McAb在正常肝组织冰冻切片上核反应为阴性（图7、图8经苏木素复染）。
图3 LSAB法检测单抗2G8与肝癌细胞Bel-7402的反应（400×）
Fig 3 Reactivity of McAb 2G8 with Bel-7402 cells by LSAB（400×）
图4 LSAB法检测单抗2G8与肝癌细胞Bel-7402反应的阴性对照（200×）
Fig 4 Reactivity of PBS with Bel-7402 cells by LSAB（200×）（negative control）
图5 LSAB法检测单抗2G8与肝癌细胞Bel-7402的反应（甲基绿复染）（400×）
Fig 5 Reactivity of McAb 2G8 with Bel-7402 cells by LSAB（restained with methylene green）（400×）
图6 LSAB法检测单抗2G8与肝癌细胞Bel-7402反应的阴性对照（甲基绿复染）（400×）
Fig 6 Reactivity of PBS with Bel-7402 cell by LSAB（restained with methylens green （400×）（negative control）
| 图7 LSAB法检测单抗2G8与肝癌组织的反应（100×）
Fig 7 Reactivity of McAb 2G8 with HCC tissue by LSAB（100×） |
图8 LSAB法检测单抗2G8与正常肝组织的反应（100×）
Fig 8 Reactivity of McAb 2G8 with normal liver tissue by LSAB（100×）
2.8.3 LSAB法检测McAb对不同细胞、组织的反应性：见表1、表2
表1 单抗2G8与人的各种细胞的反应（LSAB法）
Tab 1 Reactivity of anti-nuclear matrix McAb 2G8 with several kinds of human cells （By LSAB technique）
| Cells or cell lines |
Degree of cell nuclei colour |
| HCC cell line Bel-7402 |
++ |
| Normal umbilicl blood lymphocyte |
－ |
| Normal fibrocyte |
－ |
| Normal blood vessel endotheliocyte |
－ |
| Esophagus cancer cell line EC-8712 |
± |
| Leukemia cell line K562 |
－ |
| NPC cell line SUNE |
－ |
| Gastric carcinoma cell line 803 |
－ |
Note：＋＋ strong positive； ±weak positive；－negative
表2 单抗2G8对各种组织的反应（LSAB）法
Tab 2 Reactivity of McAb 2G8 with several kinds of tis-
sues （by LSAB technique）
| Tissues |
Number of positive／total |
| HCC |
6／6 |
| Normal liver |
0／3 |
| Embryonic liver |
0／2 |
| SUNE |
0／2 |
3 讨论 肝癌已成为全球性疾病，也是我国最常见的恶性肿瘤之一，许多学者正致力于肝癌的基础和临床的研究，单抗技术的发展为肝癌的诊治及研究提供新方法。目前针对HCC相关抗原的McAb有多种，如抗AFP、抗CEA、抗铁蛋白、抗HBX以及一些抗癌基因产物（如P53）的单抗。但所研制的单抗仍存在许多问题：①单抗特异性不高，如CEA、转铁蛋白在其它肿瘤及正常组织中也有表达；②抗原存在异质性，如抗HBX McAb只与40％的肝癌组织呈阳性反应。这些问题的存在影响单抗在肝癌的诊断和治疗中的应用。
自70年代中期，Coffey和Bereney等人明确提出核基质（NM）的概念以来，人们越来越清楚地认识到NM在细胞生命活动中所起的作用。NM是DNA组织与功能的关键调节者，是基因表达的场所，与肿瘤的发生密切相关。实验证明：肿瘤细胞相对其正常细胞有着特异性NMP。可利用肿瘤特异性NMP制备出的McAb进行肿瘤的诊断、鉴别诊断，并成为研究肿瘤发生发展的重要工具。
本实验第一次免疫动物使用肝癌细胞纯核，这样能很好地保持NM完整的三维空间结构，使其抗原性增强，取得很好的免疫效果。由图2可见纯核相对NMP在低分子量区域有较多成分，因此融合后用ELISA法进行筛选时，包被的抗原用较纯的NMP，这样可以免除NMP以外的核抗原对筛选工作的影响；同时用正常人肝细胞NMP作对照进行同步筛选，丢弃那些针对正常人肝细胞NMP的杂交瘤细胞株，保证杂交瘤细胞分泌抗体的特异性，最终制备出一株能稳定分泌抗肝癌NMP的McAb。ELISA检测发现单抗与HBsAg、HBeAg等HBV相关抗原无交叉反应；与AFP也无反应，用LSAB法鉴定其确实定位在肝癌细胞的核上，与正常肝细胞和胎肝细胞的核没有交叉反应，与4种癌细胞和3种正常细胞的反应仅发现食管癌细胞核上有较弱的阳性反应，单抗具有较好的特异性，可试用于临床检验和治疗，又可以利用它纯化出对应抗原，找寻相关基因以进一步研究肝癌的发生发展。
第一作者：女，26岁，硕士，助教
参考文献
［1］ Painta KJ，Coffey DS．A structural analysis of the role of the NM and DNA loops in the organization of the nucleus and chromosome．J Cell Sci Suppl，1984，1：123
［2］ Berezney R，Coffey DS．Nuclear protein matrix：Association with newly synthesized DNA．Science，1975，189：201
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［4］ Petti L，Sample C，Kieff E．Subnuclear localization and phosphorylation of Epstein-Barr virus latent infection nuclear proteins．Virology，1990，176：563
［5］ Kuzmina SN，Buldyaeva TV．Peculiarities of protein composition of nuclear matrix in some tumors and cultures of onbreyonic fibroblasts of chnne hamster．Biochemistry，1983，48：844
［6］ Keesee SK，Briggman JV，Thill G，et al．Utilization of nuclear matrix proteins for cancer diagnosis．Crit Rev Eukargot Gene Expr，1996，6（2～3）：189
［7］ Wen BG，Chiu JF．Monoclonal antibodies to nonhistone proteins associated with human colon cancer nuclear matrix．INT J Biochem，1987，19：321
［8］ 熊惠萍.登革病毒感染细胞抗原滴片的制备.广东医学，1991，12（1）：7
（1998-06-09收稿；1998-10-08修回）
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