脂质体介导IFNγ基因治疗小鼠肝癌的研究
免疫学杂志 1999年第3期第15卷 基础免疫学
作者：张景迎 陈诗书
单位：上海第二医科大学人类基因治疗研究中心 上海 200025
关键词：阳离子脂质体；腺相关病毒；干扰素-γ；基因转移
摘 要 以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，优化了3种阳离子脂质体的转染条件，评估了其转染效率。用构建的含腺相关病毒反向末端重复序列（AAV-ITRs）的质粒表达载体，经Dosper介导将小鼠IFNγ基因导入MM45T．Li细胞，体外有效地表达IFNγ。瘤体内注射Dosper-pAI-mIFNγ复合物可明显抑制肿瘤生长，荷瘤小鼠生存期延长。此简便、有效的非病毒转基因方法有望用于肿瘤基因治疗。
中图号 R730.59
GENE THERAPY OF HEPATOCHELLULAR CANCER WITH MOUSE IFN-γ GENE COMPLEXED TO CATIONIC LIPOSOMES
Zhang Jingying， Chen Shishu
（Human Gene Therapy Center， Shanghai Second Medical University， Shanghai 200025）
Abstract In this study， we investigated the efficiency rates of liposome-mediated gene transfection． Escherichia coli β-galactosidase gene used as a reporter gene， three different cationic liposomes were compared for their transfection efficiency， and the transfection conditions were optimized． MM45T． Li transfected with Dosper-plasmid complexes containing AAV-ITRs and IFN-γ cDNA in vitro， the efficient expression of INF-γ gene was achieved． In BALB／c mice， the growth of tumors was significantly delayed and the survival time of the treated mice was markedly prolonged following intratumor injection of Dosper-pAI-mIFNγ complexes． This simplified and efficient nonviral gene transfer method might be used in cancer gene therapy．
Key words Cationic liposomes， Adeno-associated virus， IFN-γ， Gene transfer
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一。尽管多种治疗方案已被采用，但肝癌仍是最难治愈的恶性肿瘤之一，尤其伴有多发病灶或远处转移时［1］。因此，探索新型疗法势在必行。肿瘤基因治疗虽已取得较大进展，但其效率仍待提高，关键在于有效目的基因的选择和高效、安全的转导体系的应用。已有文献表明转IFN-γ基因瘤苗较明显地抗肿瘤生长［2］。本研究采用一种新的基因转导体系，即阳离子脂质体－腺相关病毒增强型质粒复合物，将IFNγ基因导入小鼠肝癌细胞，以观察其表达情况及其体内抗肿瘤作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 Lipofectin和LipofectAMINE购自GIBCO公司。Dosper、anti-β-gal和IFNγ标准品购自Boehringer公司。质粒pAAV-LacZ由Johns Hopkins医学院储时健博士惠赠。pAI-mIFNγ由作者构建，内含强启动子CMVp、intronA、AAV-ITRs和mIFNγ cDNA（待发表）。小鼠肝癌细胞系MM45 T．Li由第二军医大学曹广文副教授惠赠。L929为本室传代保存。BALB／c小鼠，雄性，20～22g，购自上海西普尔－必凯公司。
1.2 质粒提取纯化 按试剂盒（QIAGEN公司）方法进行。
1.3 体外转染方法 于24孔板中，每孔种3×104个细胞，培养24h后转染。转染复合物制备：适量脂质体与质粒DNA分别加到50μl无血清基中，轻混后合并两液，室温置15min，加入培养板孔中，确保充分散开。培养6h后弃转染液，换正常培养基，培养48h后检测表达情况。
1.4 荷瘤小鼠模型及治疗方案 每只小鼠左腋皮下注射5×105个细胞，约12d时肿瘤长至直径6.4mm时开始治疗。荷瘤鼠随机分3组，每组6只。Dosper-pAI-mIFNγ组：每只小鼠瘤内注射复合物100μl，内含40μl Dosper和10μg DNA；Dosper-pAAV-LacZ组：注射复合物100μl，内含40μl Dosper和10μg DNA； Dosper组：只含40μl Dosper。各组每只小鼠均连续注射2次，隔2d注射一次，随后观察肿瘤生长情况及荷瘤鼠生存情况。每组另有2只鼠于最后一次注射治疗后2d取瘤组织抽RNA。
1.5 RT-PCR分析IFN-γ表达 用TRIzol抽提总RNA，逆转录后行PCR。取15μl产物电泳，扩增片段为465bp。
1.6 免疫组化检测β-gal表达 按常规法进行。Anti-β-gal稀释度为1∶50。
1.7 IFNγ活性检测 用L929的细胞毒性试验，结果用小鼠IFNγ标准品（Boehringer公司，5 000U／μg）标化。
1.8 抑瘤效应及荷瘤鼠生存情况 自治疗开始起，每隔5d测量肿瘤大小1次，结果用二垂直方向直径平均值表示，同时观察生存情况。结果经统计学方法处理。
2 结果
2.1 脂质体介导质粒DNA转染的优化 为了提高阳离子脂质体介导基因转染MM45T． Li的效率，选用3种阳离子脂质体，优化其转染条件。如图1所示，3种的最佳脂质体：DNA不同，Lipofectin和Dosper为4∶1，而LipofectAMINE为6∶1。转染效率最高的是Dosper。
2.2 Dosper介导IFNγ基因的体外表达 经效率最好的Dosper介导IFNγ基因转导MMS45T．Li显示：随pAI-mIFNγ量的增加，IFNγ活性增高，可达1 600U／（48h·ml），但超过0．9μg后，活性反而降低（见图2）。
2.3 瘤体内注射复合物后IFNγ表达 抽提瘤组
图 1不同脂质体转染效果
Fig 1Transfection efficiency rates of different liposomes
图 2IFNγ体外表达情况
Fig 2In vitro expression of IFNγ gene in MM45 T．Li
织总RNA作RT-PCR分析。如图3，Dosper-pAI-mIFNγ组可见465bp带，另两组未见此带，表明瘤组织内有IFNγ mRNA，外源IFNγ基因获得表达。
2.4 抗肿瘤作用 皮下荷瘤模型上直接瘤内注射复合物后，Dosper-pAI-mIFNγ组肿瘤生长明显受抑（P＜0．01）。治疗组小鼠平均生存时间为38±6.8d，明显高于LacZ组（28±4.5d）及Dosper组（29±6.2d）（P＜0.01）。
图 3瘤体组织RT-PCR产物电泳图
Fig 3RT-PCR analysis of INFγ from transfected tumor tissues
1：λ-DNA／Hind Ⅲ marker； 2：Dosper-pAI-mINFγ group；
3：Dosper-pAAV-LacZ group； 4：Dosper group
图 4治疗后各组肿瘤生长情况
Fig 4Growth of tumors after treatment
3 讨论
阳离子脂质体介导基因转移技术是目前应用较多、很有发展前途的非病毒转移方法。新的阳离子脂质体不断研制成功，将大大提高其转导效率［3］。此外，所用真核质粒表达载体的优化改造将有助于进一步提高表达能力［4，5］。Philip等研究表明，含AAV-ITRs质粒载体可明显提高阳离子脂质体介导的基因表达效率，且可在分裂及非分裂细胞中较长时间表达［6］。利用此类载体已成功地将IL-2基因导入前列腺瘤、乳腺癌、卵巢癌及胰腺癌细胞，并获得较高水平、较长时间表达，照射后的瘤苗可诱导机体产生明显的抗肿瘤免疫［7］。此类ex vivo方法较繁琐。我们在构建的AAV增强型质粒基础上，先用报告基因观察了3种脂质体转染效率，显示Dosper最好。最佳条件下，体外将IFNγ基因导入MM45T．Li，表达活性达1 600U／（48h·ml）。在荷瘤模型上，IFNγ可明显抑制肿瘤生长，荷瘤鼠寿命延长，其机理可能是上调抗原加工和递呈因子（如MHC I等），调节细胞毒T细胞的诱导，Mφ、NK和LAK的激活及其它免疫调节因子的诱导［8］。至于AAV质粒载体提高基因表达水平及延长表达时间，可能与AAV-ITRs促进质粒在核内聚集有关，但详细机理有待进一步研究。
第一作者：男，34岁，博士
参考文献
1 张景迎，陈诗书.肝细胞癌基因治疗的实验性研究进展.医学综述，1998，4：1
2 雷 虹，曹雪涛，于益芝，等.腺病毒介导IFN-γ基因转染的瘤苗体内抗肿瘤转移作用.免疫学杂志，1996，13：29
3 Felgner PL． Improvements in cationic liposomes for in vivo gene transfer． Hum Gene Ther， 1996， 7：1791
4 Yew NS， Wysokenski DM， Wang KX， et al． Optimization of plasmid vectors for high-level expression in lung epithelial cells． Hum Gene Ther， 1997， 8：575
5 Vieweg J， Boczkowski D， Roberson KM， et al． Efficient gene transfer with adeno-associated virus based plasmids complexed to cationic liposomes for gene therapy of human prostate cancer． Cancer Res， 1995， 55：2366
6 Philip R， Brunette E， Kilinski L， et al． Efficient and sustained gene expression in primary T lymphocytes and primary and cultured turnor cells mediated by adeno-associated virus plasmid DNA complexed to cationic liposomes． Mol Cell Biol， 1994， 14：2411
7 Clary BM， Covency EC， Philip R， et al． Inhibition of established pancreatic cancers following specific active immunotherapy with interleukin-2 gene-transduced tumor cells． Cancer Gene Therapy， 1997， 4：97
8 Rosenthal FM， Cronin K， Bannerji R， et al． Augmentation of antitumor immunity by tumor cells transduced with a retroviral vector carrying the interleukin-2 and interferin-γ cDNAs． Blood， 1994， 83：1289
（1998-07-06收稿；1999-02-25修回）
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