CD28与B7.1共刺激PBLs受肝癌细胞诱导后的TCR Vβ基因表达

免疫学杂志 2000年第1期第16卷 基础免疫学

作者：杨红　李菁华　黄树林

单位：杨红（广东药学院分子生物学研究室，广东 广州 510224)； 黄树林（广东药学院分子生物学研究室，广东 广州 510224)； 李菁华(白求恩医科大学微生物学教研室，吉林 长春130021）

关键词：TCR Vβ基因；CD28＋B7．1（CD80）；基因表达

　　摘　要：目的 研究T细胞受体（TCR）Vβ在外周血淋巴细胞（PBLs）中的表达。方法 用单克隆抗体CD28＋B7．1（CD80）共刺激正常人外周血淋巴细胞后作用于肝癌细胞（BEL-7402）。结果 发现PBLs TCR Vβ7基因在体外选择性扩增，表达水平为15％～25％，对照组为4％～8％。结论 Vβ7基因对识别肿瘤抗原具有特异性，为肿瘤基因治疗和研究提供新的线索和实验依据。

　　中图分类号：R392.11　文献标识码：A

Selective expression of TCR Vβ gene in PBLs costimulated by

　　CD28＋B7．1 and induced by hepatoma cell

YANG Hong　HUANG Shu-lin

　　（Department of Molecular Biology， Guangdong Pharmacy College， Guangzhou 510224，China)

　　LI JING-hua

　　(Department of microbiology，Bethune University of Medical Sciences，Changchun 130021，China）

　　Abstract：Objective To investig　ate selective expression of T cell receptor（TCR） Vβ gene in peripheral blood lymphocytes（PBLs）．Methods The healthy human PBLs were costimulated by anti-CD28 and anti-CD80（B7．1） McAb and induced by hepatoma cells（BEL-7402）．Results TCR Vβ7 gene were selectively amplified in PBLs induced by BEL-7402 cells and the expression level of Vβ7 was much higher in these cells than in controls （15％～25％ vs 4％～8％）．Conclusion Vβ7 gene may specialize in recognizing tumor antigen． Our study offers new clues and experimental basis for gene treatment of tumor．

　　Key words：TCR Vβ gene； CD28＋B7．1（CD80）；gene expression▲

　　TCR是参与特异性免疫的重要分子，在T淋巴细胞活化过程中识别和结合配体。研究发现正常个体在抗原刺激下，外周血淋巴细胞（PBLs）TCR Vβ基因随抗原类型不同或疾病的不同临床阶段呈选择性扩增^［1］。大量实验证实，抗原（Ag）与TCR的结合仅仅是免疫应答的开始，只有当抗原递呈细胞（APC）表达B7分子，作用于T细胞表面的CD28受体作为第二刺激信号，T细胞才被激活，分裂增殖。在生理状态下，未经刺激的APC表面不表达B7.1分子或表达水平极低不能引起有效的抗肿瘤免疫应答，CD28与B7.1的相互作用提供了T细胞活化所必需的主要共刺激信号^［2］。为更好地增强APC呈递能力和提供充足的共刺激信号，本研究用CD28＋B7．1（CD80）共激活PBLs后作用肝癌细胞（BEL-7402），研究探讨PBLs TCR Vβ亚家族基因的选择性表达特征。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂及仪器

　　抗CD28、CD80单克隆抗体（McAb）冻干粉购自Immunotech公司；Taq DNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNAsin、dNTPs、DTT购自Promaga公司，DEPC、RPMI1640购自Sigma公司；其他试剂为国产AR试剂。基因扩增仪GeneE（英国），CO₂培养箱BNA-311（日本），凝胶成象扫描仪Gel Doc-1000（Bio-Rad）。

　　1.2　方法

　　1.2.1　淋巴细胞培养：健康成年人全血购自市中心血站。100ml血用Ficoll密度梯度离心分离单核细胞，用RPMI 1640培养（含10％灭活小牛血清），每管10ml，分别加入维持量IL-2（20u／ml）、CD28＋CD80（各为0．4μg／ml），在37°C、5％CO₂孵箱中培养3d。

　　1.2.2　肝癌细胞（BEL-7402）培养：肝癌细胞系（BEL-7402）由中山医科大学肿瘤所赠。用0.25％胰蛋白酶消化，加2ml 1640液吹散细胞，再加入含10％小牛血清的1640液，共10ml。在37°C、5％CO₂孵箱中培养，直至形成单层细胞，倾出培养液，加入抗体诱导的淋巴细胞培养1d，对照组不作用肝癌细胞，收获细胞，－70°C保存备用。

　　1.2.3　RNA提取： RNA提取参见CHOMCZY-NSKI方法^［3］。

　　1.2.4　引物设计： 参见文献［4，5］，序列见文献［12］。

　　1.2.5　cDNA合成、RT-PCR检测TCR Vβ基因：参见文献［6］。

　　1.2.6　探针标记、Southern杂交、化学发光与X光片显影等（Lumi-phos530）：见文献［7］。

　　1.2.7　图象分析^［5］：Southern杂交后的X-胶片用凝胶成象扫描仪进行处理，TCR Vβ所形成的一条密度带被转化为数字，用NIH-图象分析软件（1.57版本）在计算机上进行处理，用公式：（Vβ的密度）×100／（Vβ1-22）的累积密度，计算TCR Vβ的相关频率^［8］。

　　2　结果

　　2.1　TCR Vβ基因Southern杂交　图1是CD28＋CD80协同刺激健康人PBLs（对照组）及受肝癌细胞BEL-7402诱导（实验组）后TCR Vβ基因PCR产物Southern杂交印迹图。由图可见，在肝癌抗原刺激下，PBLs中TCR Vβ7亚家族基因片段呈选择性优势扩增（见箭头所示）。

图1　PBLs TCR Vβ基因PCR产物Southern杂交图谱

　　Fig1　Southern hybridization map of PBLs TCR Vβ gene PCR product

　　A（control）：Southern hybridization map of TCR Vβ gene PCR product costimulated by CD28＋CD80

　　B（treatment）：Southern hybridization map TCR Vβ gene PCR product costimulated by CD28＋CD80， and induced by hepatoma cells

　　2.2　TCR Vβ基因表达水平检测　图2是CD28＋CD80协同刺激健康人PBLs（对照组）及受肝癌细胞BEL-7402诱导（实验组）后，PBLs TCR Vβ基因表达水平检测。光密度扫描结果显示，在肝癌抗原刺激下，Vβ7亚家族基因表达显著升高，表达水平为24.41％。

图2　PBLs TCR Vβ基因亚家族表达水平（％）

　　Fig2　The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs （％）

　　Control： The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs costimulated by CD28＋CD80

　　Treatment：The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs costimulated by CD28＋CD80 and induced by hepatoma cells

　　3　讨论

　　TCR是T淋巴细胞接受抗原刺激产生特异性免疫应答的受体，多数T细胞的TCR由α、β链构成，人体TCR β链V基因有25个片段供挑选组成TCR受体库。在没有抗原刺激时，TCR Vβ基因的表达完全是随机的^［9］。目前的研究热点在TCR V区基因对抗原的识别机制和特异性表达上，特别是TCR Vβ基因亚家族的使用频率和选择性扩增。有报道，IL-2作用下人TIL的TCR Vβ5、6、8基因呈优势扩增^［1］，SIV感染恒河猴淋巴细胞，Vβ7、14基因呈高表达^［10］。本室用HSV-2感染健康人PBLs时TCR Vβ2、6、7、8基因表达频率增高，而生殖器单纯疱疹性皮肤病人发作期、中间静止期和再发作期的PBLs用HSV感染时，TCR Vβ基因的表达却不同。这提示在疾病不同发病阶段外周血T细胞识别抗原时，Vβ基因亚家族呈不同的优势扩增^［11］。T细胞被激活时除其表面抗原特异性受体感受抗原多肽的刺激之外，另一些受体也必须感受并传递一个附加刺激的受体即CD28，CD28传递的信息可防止T细胞特异性抗原诱发的耐受，同时可以使激活的T细胞内各种细胞因子mRNA（如IL-2mRNA）的稳定性增加。B7.1可使APC表面B7.1分子表达增多，CD28与B7.1的相互作用产生的共刺激信号加强抗原呈递能力，是T细胞应答产生CTL的诱导相中所必需的，是典型的共刺激途径。本文用CD28＋B7．1（CD80）协同刺激健康人PBLs后作用于肝癌细胞，结果显示PBLs TCR Vβ7表达水平明显增高，而其它Vβ亚家族基因的表达水平无明显改变，但有个体差异,说明PBLs TCR在接受抗原刺激过程中，Vβ7特异性识别肿瘤抗原而呈优势扩增，且表达水平稳定，为我们下一步研究工作——肿瘤的基因治疗提供特异性片段。■

　　基金项目：国家自然科学基金（396400005）和广东省科教兴医“五个一”工程重点课题（粤卫科［1996］20号）资助项目

　　作者简介：杨 红（1965-），女，广东人，讲师，本科，主要从事分子免疫学方面的研究。

　　参考文献：

　　［1］傅体辉．T细胞识别肿瘤的分子机制［J］．国外医学免疫学分册，1995，1：23～26．

　　［2］黄树林，罗利琼，肖兰凤，等．McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡［J］．中国免疫学杂志，1998，14（2）：154～156．

　　［3］CHOMCZYNSKIS P， NICOLETTA S． Single-step method of RNA isolation by acid guannidinium thiocganate-phenol-chloroform extraction［J］． Analytical Biochem， 1987，162：156～159．

　　［4］ILONA KARIV， ALEMSEGED TRUNEH， RAYMOND W SWEET． Analysis of the site of interaction of CD28 with its counter-receptors CD80 and CD86 and correlation with founction［J］． J Immunol， 1996，157：29～32．

　　［5］DUNN DA， ANNE SG， SWARNALATHA S， et al． T-cell receptor Vβ expression in normal human skin［J］． Proc Natl Acad Sci（USA）， 1993，90：1267～1270．

　　［6］HIDEYUKI I， NORIYUKI S， AKIHIRO M， et al． Analysis of T-cell receptor Vβ region gene usage of cytotoxic T-lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocytes derivid from human autologous gastric sigmer ring cell carcinomas［J］． Cancer Res，1993，53：3078～3081．

　　［7］黄树林，陈耕夫，杨 红，等．不同条件和状态HSV感染人外周血淋巴细胞的Vβ受体表达特点［J］．中国免疫学杂志，1996，12（增刊）：137～140．

　　［8］MAMHEIM B． Principle of nucleic acid labeling and detection with the genius system［J］． Genius System User S Guide， 1994，22，44～46，66～68．

　　［9］JEFFERY MC， MICHAEL JL． Antigen induced programmed T cell death as a new approach to immune therapy：Clinic immunology and immunopathalogy， 1995，75：13～16．

　　［10］ZHANG WC， KOU ZC， LING S． An acutely lethal simian immunodeficiency virus stimulates expansion of Vβ7-14 expressing T lymphocytes［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1994，9：7501～7505．

　　［11］黄树林，明文玉，罗利琼，等．HSV-2感染人外周血淋巴细胞后TCR Vβ基因片段的选择性扩增［J］．上海免疫学杂志，1997，2：98～101．

收稿日期：1998-06-09

修回日期：1999-10-03