G-CSF对急性髓系白血病细胞原发性mdr1/P-gp表达的调节作用研究
中华血液学杂志 1998年第7期第19卷 论 著
作者：安峻峰 陈济民 李秀珍 梅广义 谢燕 高清平 王巧玲
单位：430060 武汉,湖北医科大学附属第一医院［安峻峰(现在广东医学院附属医院 湛江 524001)、陈济民、李秀珍、梅广义、谢燕、高清平、王巧玲］
关键词： 粒细胞集落刺激因子；白血病细胞；细胞分化；抗药性，多药；基因表达
摘要 目的：探讨白血病细胞分化与多药耐药基因(mdr1)表达之间的内在联系和机制。方法:应用细胞培养、免疫细胞化学、逆转录-聚合酶链反应和MTT等方法在体外观察粒系集落刺激因子对急性髓系白血病细胞诱导分化作用及细胞分化前后mdr1/P-pg表达水平变化。结果：分化后的细胞mdr1/P-gp表达水平较分化前明显下降，并且随mdr1/P-gp下降，细胞对柔红霉素敏感性明显增加。结论：白血病细胞分化与mdr1表达密切相关，利用诱导分化剂从基因水平逆转白血病多药耐药形成可能是一种克服白血病患者耐药的行之有效的方法。
The modulation effect of granulocyte-colony stimulating factor on the mdr1/P-gp expression in acute myeloid leukemic cells An Junfeng,Chen Jimin,Li Xiuzhen,et al.First Affiliated Hospital,Hubei Medical University,Wuhan 430060
Abstract Objective:To investigate the correlation between cell differentiation and mdr1 gene expression in acute myeloid leukemic(AML) cells.Methods:The modulation effect of granulocyte-colony stimulating factor(G-CSF) on the mdr1 gene expression in AML cells was studied in vitro by using polymerase chain reaction(PCR),in vitro cell culture,immunocytochemical and MTT assays.Results:AML cells retained the ability to respond to the differentiation stimulus.Expressions of P-glycoprotein(P-gp) and mdr1 mRNA were downregulated in differentiated cells,meanwhile,a significant decrease of DNR IC50 in the AML cells with down-expression mdr1 gene was revealed and their sensitivity to anti-cancer drugs increased.Conclusion:Leukemic cell differentiation was closely correlated with mdr1 expression.It might be an effective method to overcome drug resistance of leukemic patient by using differentiation inducing agents.
Key words Granulocyte-colony stimulating factor Leukemic cell Cell differentiation Drug resistance,multiple Gene expression
多药耐药是肿瘤化疗失败的重要原因，虽然目前对逆转多药耐药基因(mdr1)产物P-糖蛋白(P-gp)的研究很多，但从基因水平调节mdr1/P-gp表达的研究国内外尚少报道。为此，我们观察了诱导分化剂对急性髓系白血病细胞原发性mdr1/P-gp表达的调节作用。
病例和方法
1 对象 按FAB分型确诊的初诊急性髓系白血病(AML)患者31例，其中M1 2例，M2 8例，M3 7例，M46例,M5 8例;男18例，女13例,年龄16～63岁。正常人3名。
2 主要试剂 伊思柯夫改良培养基 (IMDM)为Sigma公司产品，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)由日本麒麟公司惠赠,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)肿瘤mdr1检测试剂盒［内含逆转录反应缓冲液，RNasin，逆转录酶，PCR缓冲液，β2-微球蛋白(β2-MG)上、下游引物,mdr1上、下游引物等］购自北京聚杰公司,单克隆抗体（单抗）CD11b、CD34由军事医学科学院基础医学研究所提供,CD13、CD14、CD15、CD33由中国医学科学院血液学研究所免疫室提供，抗P-gp单抗(JSB-1)、SP检测和DAB显色试剂盒购自福建迈新公司,多药耐药细胞系K562/AO2和敏感细胞系HL-60细胞涂片由中国医学科学院血液学研究所杨纯正教授提供,碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)检测试剂盒由卫生部武汉生物制品研究所提供。
3 白血病细胞分离、培养和实验分组 白血病细胞均在患者就诊时取自骨髓，全部病例白血病细胞均占有核细胞的0.85以上。按常规法分离提取白血病细胞,添加15%的灭活小牛血清(浓度由预试验确定)配成单个核细胞(MNC)悬液，按5×106/ml的浓度接种于以下各组培养瓶中，并分别加入以下各药:①空白对照(CON)，只添加含15%小牛血清的IMDM培养液；②添加终浓度为20ng/ml G-CSF［1］。然后置于37℃，含5%CO2的饱和湿度培养箱中培养7天，每组重复4次。
4 细胞形态及细胞化学 按本室常规进行 Wright- Giemsa及α-醋酸萘酚酯酶及氯乙酸萘酚酯酶染色，光镜下检测，随机计数200个细胞。
5 四氮唑蓝(NBT)还原试验 参照Collins等方法［2］并作改进，随机计数200个细胞，胞浆内见紫黑色甲月替沉积为阳性。
6 细胞膜抗原的检测 采用APAAP法。阳性反应为红色，定位在胞浆和胞膜，计数200个细胞，计算出阳性百分率，以阳性细胞≥30%者为该抗原表达阳性，否则为阴性［3］。
7 P-gp表达检测 细胞悬液涂片,空气干燥,用SP检测试剂盒检测。光镜下计数500个细胞。每次操作均分别设多药耐药细胞系K562/AO2和HL-60为阳性和阴性对照。胞浆或胞膜着棕黄色者为阳性，不着色者为阴性，然后计算出阳性细胞百分率。P-gp阳性细胞＞10%为mdr1表达(或P-gp表达阳性),5%～10%为可疑表达,＜5%为阴性［4］。
8 RNA制备 取正常人或患者骨髓液2ml,常规法分离单个核细胞,采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的量，尿素变性电泳鉴定RNA的质量，-80℃冻存备用。
9 cDNA合成和PCR扩增 引物设计参考文献［5］。参照检测盒提供的条件，取AML细胞总RNA3μg，加入逆转录反应体系，42℃反应1小时。然后加入80ng DNA模板(经点板定量，约2μl)于PCR反应体系中，95℃变性8分钟(灭活逆转录酶),Taq酶2μl混匀后覆盖矿物油30μl,然后93℃变性50秒,50℃退火40秒,72℃延伸60秒,扩增33个循环得到mdr1和β2-MG的扩增产物。以2.5%琼脂糖凝胶电泳，pBR322/HinfⅠ作为分子量标准，固定泳动距离下，溴化乙锭染色，阳性标本紫外光下可见两条扩增产物带,157bp的为mdr1,115bp的为β2-MG，然后摄片，激光密度扫描仪扫描底片，并计算曲线下峰面积作为产物含量,用mdr1 mRNA和β2-MG mRNA的比值表示mdr1 RNA的表达水平。
10 细胞毒性测定 参照MTT法［6］并加改进。取培养前后细胞悬液加入96孔灭菌培养板,每孔180μl,内含细胞0.5×105/ml，然后加入20μl不同浓度的柔红霉素(DNR)。每个浓度重复8孔,置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养24小时，加入20μlMTT(5mg/ml,用PBS配制)后继续培养4小时，2000r/min离心10分钟，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200μl溶解沉淀的甲月替,用酶标仪在540nm波长下测定每孔A(吸光度，曾称光密度OD)值。取8孔平均值，按下式计算药物对细胞的抑制率：
11 统计学处理 t检验、χ2检验或直接概率法及相关回归分析。
结 果
1 细胞形态学和细胞化学改变 31例AML细胞经G-CSF作用7天后形态学观察,其中15例(M11例,M23例，M34例，M43例和M54例)分化成熟细胞比例明显增加。结合细胞化学染色，除3例分别向粒-单核系和单核细胞方向分化外，其余各例均向粒系方向分化。
2 NBT还原率和细胞膜分化抗原变化 经G-CSF诱导后AML细胞NBT还原率增加,分化与未分化细胞比较有明显差异(P＜0.001)。分化组细胞膜分化抗原CD11b(66.7%)和CD15(80.0%)阳性表达率明显增加，同时代表细胞早期阶段的膜分化抗原CD13和CD33表达率明显下降或转阴。
3 mdr1在AML细胞的表达 31例AML患者中13例(41.94%)具有mdr1基因表达。不同AML亚型的mdr1表达以M5最高，M3最低。
4 细胞分化与mdr1/P-gp表达的关系 我们选择了在绝大多数不同类型细胞均高表达，且表达水平相近的β2-MG基因作为内对照。据研究,耐药水平与其细胞膜表面P-gp密度呈正相关，β2-MG表达水平与胞膜面积亦密切相关［5］，因而，分化前后的细胞其胞膜面β2-MG变化不大,若mdr1/P-gp表达水平发生变化,两者的比值(mdr1 mRNA/β2-MG mRNA)就能反映出诱导分化前后AML细胞mdr1 RNA的变化，同时消除了实验本身诸因素的干扰。结果表明，13例表达mdr1/P-gp患者的白血病细胞在G-CSF作用下,经细胞形态学、细胞化学、膜分化抗原及NBT还原能力检测,有8例分化成熟。分化组8例中有6例AML细胞mdr1 RNA水平下降,其中3例降至0,1例降至正常人表达水平;未分化组5例中,1例降至0,1例表达水平虽下降但高于正常人表达水平。免疫组化技术检测发现，分化组8例中4例P-gp阴转,1例降为可疑阳性；未分化组5例中1例阴转,1例表达水平较诱导前下降,但仍呈阳性。分化组mdr1/P-gp下降与未分化组比较有显著差异(P＜0.05)(表1)，并且P-gp与mdr1 RNA下降明显相关(r=0.98)。
表1 细胞分化与其mdr1 mRNA/P-gp表达的关系
| 例号 |
诱导前 |
诱导后 |
| 分化组△ |
未分化组*# |
| R值 |
P-gp(%) |
R值 |
P-gp(%) |
R值 |
P-gp(%) |
| 1 |
0.412 |
23.20 |
0.412 |
23.20 |
|
|
| 2 |
0.108 |
10.80 |
0 |
1.60 |
|
|
| 3 |
0.112 |
11.60 |
0.100 |
4.40 |
|
|
| 4 |
0.120 |
11.70 |
0 |
4.80 |
|
|
| 5 |
0.110 |
10.70 |
0 |
2.10 |
|
|
| 6 |
0.352 |
18.50 |
0.104 |
9.20 |
|
|
| 7 |
0.408 |
20.30 |
0.210 |
12.10 |
|
|
| 8 |
0.490 |
33.50 |
0.490 |
30.50 |
|
|
| 9 |
0.400 |
21.60 |
|
|
0.400 |
19.60 |
| 10 |
0.307 |
14.40 |
|
|
0.107 |
10.40 |
| 11 |
0.560 |
48.20 |
|
|
0.560 |
48.20 |
| 12 |
0.130 |
13.10 |
|
|
0 |
3.10 |
| 13 |
0.317 |
16.20 |
|
|
0.317 |
16.20 |
R值为mdr1 mRNA/β2-MG mRNA;△与诱导前比，P＜0.01;*与诱导前比，P＜0.05;#与分化组比，P＜0.055 AML细胞mdr1 rNA/P-gp变化与DNR敏感性的关系 从表2中AML细胞的DNR半数细胞抑制剂量(IC50)可看出,AML细胞分化后,随其内在性mdr1 rNA/P-gp表达水平下调，对DNR的敏感性显著增加(P＜0.001)，并且P-gp阴转组与未阴转组比较也有差异(P ＜0.05)。
表2 AML细胞mdr1 RNA/P-gp表达与其对DNR敏感性关系
| 对照组 |
13 |
22.15±2.89 |
| 分化组 |
8 |
4.79±4.12△ |
| 未分化组 |
5 |
10.94±4.19# |
| 分化伴P-gp阴转组 |
4 |
1.92±1.86 |
| 分化伴P-gp未阴转组 |
4 |
7.66±3.77* |
△与对照组比,P＜0.001;#与分化组比,P＜0.05;与分化组比,P＞0.2;*与分化伴P-gp阴转组比,P＜0.05
讨 论
Bates等［7］通过诱导分化剂调节mdr1基因表达,采用人类结肠癌和神经母细胞瘤细胞系作为研究模型,首先发现用DMSO、维甲酸和丁酸钠后随癌细胞分化成熟,mdr1基因表达增加。但在造血组织和AML细胞中情况恰好相反［8］,即正常造血细胞和AML细胞中mdr1表达常常与CD34阳性的造血干细胞或非成熟细胞表型密切相关,而粒细胞和分化较好的白血病细胞mdr1表达水平很低。从而强烈提示mdr1表达有可能随细胞分化而下调或消失。
我们以G-CSF为诱导分化剂,以13例表达mdr1/P-gp的AML白血病细胞作为研究模型，利用RT-PCR和免疫组化技术检测其诱导AML细胞分化前后mdr1/P-gp表达水平的变化。发现被G-CSF诱导分化的细胞mdr1/P-gp表达水平较未分化的细胞表达水平显著降低。值得注意的是mdr1表达水平变化与P-gp变化有明显相关性,说明P-gp降低可能是由于mdr1 RNA下降引起的。这与国外某些作者的结果不同［9］。究其原因可能与各自选择的研究对象不同有关。
为验证mdr1/P-gp下降的临床意义,我们测定了AML细胞的DNR的IC50。结果发现,mdr1 rNA/P-gp阳性阴转组对DNR敏感性较未阴转组明显增加,说明mdr1 rNA/P-gp下调可能导致AML细胞内DNR外排减少、积聚增加，从而增强了DNR对AML细胞的杀伤力。
上述结果提示，白血病细胞分化与mdr1表达有着密切的内在联系，利用诱导分化剂，从基因水平逆转白血病多药耐药形成可能是一种克服白血病患者耐药行之有效的方法。
参 考 文 献
1 Colombat PH,Santni V,Delwel R,et al.Primary human acute myeloblastic leukemia:an analysis of in vitro granulocytic maturation following stimulation with retinoic acid and G-CSF.Br J Haematol,1991,79:382-389.
2 Collins SJ,Bodner A,Ting R.Induction of morphological and functional differentiation of human promyelocytic leukemia cells(HL60) by compounds which induce differentiation of murine leukemia cells.Intern J Cancer,1980,25:213-218.
3 李惠芳,孙桂香,卢薇薇,等.白血病多药耐药基因表达与细胞表面分化抗原的关系.中华血液学杂志,1995,16:75-77.
4 杨纯正,栾风君,刘炳仁,等.白血病多药耐药检测.中华血液学杂志,1992,13:421.
5 Noonan KE,Beck C,Holzmayer TA,et al.Quantitative analysis of mdr1(multidrug resistance) gene expression in human tumours by polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:7160-7164.
6 Carmichael J,Degnaff WG,Gadzer AF,et al.Evaluation a tetrazolium based semiautomated colorimetric assessment of chemosensitivity testing.Cancer Res,1987,47:936-942.
7 Bates SE,Mickley LA,Cheny N,et al.Expression of multidrug resistance gene in human neuroblastoma cell lines:modulation by retinoic acid induced differentiation.Mol Cell Biol,1989,9:4377-4383.
8 Miyachi H,Takemura Y,Yonekura S,et al.MDR1(multidrug resistance) gene expression in adult acute leukemia:correlations with blast phenotype.Intern J Haematol,1993,57:31-36.
9 Marks DC,Davey MW,Davey RA,et al.Differentiation and multidrug resistance in response to drug treatment in the K562 human leukemia cell lines.Br J Haematol,1993,84:83-89.
(收稿:1997-09-11 修回:1998-01-05)
(校对:董文革)
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