乳猪肝提取物和阿霉素对裸小鼠肾包膜下移植肝癌细胞增殖、分化和凋亡影响的实验研究

中国病理生理杂志 2000年第7期第16卷 论著

作者：邹清雁　刘钢　黄冰　陈系古　黄文革　孔祥平

单位：邹清雁　刘钢　孔祥平（中国人民解放军第458医院，广东 广州 510602）；黄冰　陈系古　黄文革（中山医科大学动物实验中心）

关键词：生长抑制物；阿霉素；小鼠，裸； 肝细胞瘤

　　［摘　要］　目的：探讨乳猪肝提取物(LE)和阿霉素(doxorubicin, DXR)对裸小鼠肾包膜下移植BEL-7402肝癌细胞增殖、分化和凋亡的影响。方法：应用裸小鼠肾包膜下移植肝癌细胞，形态学观察，有丝分裂计数，超微结构观察和原位DNA末端标记技术。结果：LE组和DXR组均能明显抑制移植肝癌细胞的生长和促进凋亡。LE对肝癌细胞有丝分裂影响不明显，而DXR能抑制其有丝分裂。电镜观察表明：LE能促进细胞凋亡超微结构的变化，表现为细胞固缩、微绒毛消失、核染色质边集固缩和凋亡小体形成，而对细胞分化影响不明显。DXR组除有凋亡待征的超微结构变化外，还具有促进肝癌细胞分化的作用。结论：LE能诱发移植于裸小鼠BEL-7402肝癌细胞凋亡，而对其分化和增殖影响不明显。DXR能促进裸小鼠肝癌细胞凋亡和分化，抑制其增殖。

　　［中图分类号］　R73-36　　　［文献标识码］　A

　　［文章编号］　1000-4718(2000)07-0581-04

Effects of sucking porcine liver extracts and doxorubicin on BEL-7402

　　hepatoma cells transplanted in renal capsule of BALB/C nude mice

ZOU Qing-yan,　LIU Gang，KONG Xiang-ping

　　(Guangzhou Air Force Hospital of PLA, Guangzhou 510602, China)

　　HUANG Bing，CHEN Xi-gu，HUANG Wen-ge

　　(Center of Experimental Animal, Sun Yet-sen Medical University, Guangzhou, China)

　　［Abstract］　AIM: To investigate the effect of sucking porcine liver extracts (LE) and doxorubicin (DXR) on BEL-7402 hepatoma cells in the renal capsulae of BALB/c nude mice. METHODS: Histo-cellular morphology, mitotic counting, ultrastructural observation and in situ DNA labeling apoptotic detection were performed. RESULTS: Both LE and DXR can apparently inhibit the tumors' growth and induce the apotosis of hepatoma cells. LE exerted no apparent effect on the hepatoma cell mitosis, but DXR inhibited it. Electron-microscopic observations showed LE can induce the hepatoma cells to apoptosis. CONCLUSIONS: LE can induce the hepatoma cells to apoptosis, but has no apparent effect of their differentiation and proliferation. DXR can not only induce the hepatoma cells to apoptosis and inhibit their growth, but also can promote their differentiation.

　　［MeSH］　Growth inhibitors; Doxorubicin; Mice, nude; Hepatoma

　　肝提取物(liver extract, LE)是从乳猪肝提取物中分离纯化的一类多肽，体外实验证实，LE能抑制某些肝癌细胞生长和促进部分癌细胞凋亡^［1］，这种诱导凋亡物质的分子量为4.02 kD^［2，3］。为探讨LE对体内肝癌细胞的影响，我们采用BEL-7402肝癌细胞进行裸小鼠肾包膜下移植，以DXR为抗癌阳性对照，利用组织细胞形态学，电镜超微结构观察和原位细胞DNA末端标记技术观察LE和DXR对BEL-7402细胞的影响。

　　材　料　和　方　法

　　一、LE组份的制备，参见文献^［3］的制备方法。

　　二、裸小鼠肾包膜下BEL-7402肝癌细胞移植

　　(一)裸小鼠皮下瘤的建立　BEL-7402肝癌细胞(由中山医科大学实验动物中心细胞库提 供)，用含15%小牛血清的RPMI-1640完全培养液培养，对数生长期细胞用0.25%胰酶消化成1.46×10⁷／mL的细胞悬液，0.3 mL/只，于BALB/c裸小鼠右侧颈部皮下注射，待肿块长至0.8 cm×0.8　cm×0.8　cm左右，作肾包膜下移植。

　　(二)瘤块移植　肝癌细胞裸小鼠皮下瘤无菌切成1 mm³左右，作裸小鼠双肾包膜下移植，移植后用测微器测肿瘤小块的长径和横径。

　　三、动物分组及给药

　　肾包膜下移植后第3 d开始给药，18只裸小鼠(18～22 g)分成3组，每组6只。(一)LE组，LE，10 mg/kg体重。(二)DXR组，DXR(意大利Farmitalia Carlo Erba研究室产品)，2.0 mg/kg体重。(三)阴性对照组，生理盐水0.4 mL/只裸小鼠。所有动物均经腹腔内注射给药，1次/d，连续16 d。停药后第2 d处死裸小鼠，用测微器测肾包膜下肿瘤小块的长径和横径，所得数据及裸鼠体重输入电脑软件得出抑瘤率及t值。肿瘤小块分别做石蜡切片，苏木素和伊红染色，光镜观察，有丝分裂计数和超薄切片，铀、铅染色，超微结构观察。

　　四、DNA原位末端标记试验

　　DNA原位末端标记(TUNEL)试剂盒购自德国宝灵曼(Boehringer Mannheim)公司。组织切片经脱蜡后浸入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)经0.03% H₂O₂甲醇30 min, 0.01% Triton 0.01 mol/L Tris HCl(pH 7.4)2 min后按说明书操作，以PBS代替TUNEL反应液作阴性对照，以细胞核有明显棕黄色为阳性细胞。每切片观察10个高倍视野，随机计数2000个细胞中的阳性细胞数，计数时避开中央坏死区，并计算每100个细胞中阳性染色细胞数为标记指数(label index, LI)。

　　五、数据以±s, 采用F方差检验。

　　结　　果

　　一、细胞形态学观察

　　对照组7402肝癌细胞呈多角型，排列密集。核大，染色深，可见巨核细胞，胞质少而染色深，有丝分裂多见。可见部分细胞核固缩，染色深，部分核呈分叶状。瘤组织中央可见坏死灶(图1A)。DNA原位末端标记结果显示，凋亡细胞数较少(图2A)。LE组，细胞形态与对照组相似，可见细胞核固缩，核碎裂增加(图1B)。DNA原位末端标记结果显示，凋亡细胞数增加(图2B)。DXR组，细胞呈多角型，排裂较规则，呈条索状，似肝硬化结节状；核染色较对照组和LE组浅且较规则，胞质比例增加而染色较浅红，胞质内可见空泡结构；可见细胞核固缩，核碎裂明显增加，少许细胞核呈分叶状(图1C)。DNA原位末端标记结果显示，凋亡细胞数明显增加(图2C)。

　　二、细胞超微结构观察

　　对照组细胞呈多角型，核呈不规则型，比例大，染色较均匀。可见少量粗面内质网和线粒体，但形态不规则。游离核糖体多而密集，胞饮空泡多见。细胞间隙较大，细胞伪足多。偶见细胞核染色质边集，深染，核固缩呈分叶状(图3A)。LE组细胞形态与对照组相似，但细胞排列较密集，细胞间隙较小，伪足短而少。部分细胞固缩，表面微绒毛减少，消失。核染色质边集，核固缩多见，细胞核被膜包裹，分割形成凋亡小体(图3B)。DXR组，核大较规则，胞质/核比例增加，核膜下异染色质增多；胞质内游离核糖体明显减少，同时粗面内质网、线粒体数量较对照组明显增加，可见明确的线粒体嵴和腔，可见发育不全的高尔基复合体；细胞排列密集，细胞间连接清晰，可见中间连接，紧密连接和桥粒结构，在桥粒与桥粒之间可见胆小管形成(图3C)。

Fig 3 Electron micrograph of the hepatoma cells transplanted in nude mice

　　control group (3A), LE group (3B), DXR group(3C),(↑) apoptotic body, (BD)biliary ductule, stainde by uranium and lead, ×4000

3　裸小鼠包膜下移植肝癌细胞的电镜形态学观察

　　三、对移植肝癌组织生长和凋亡的影响

表1　LE和DXR对移植肝癌细胞的抑瘤率

　　Tab 1 Effect of LE and DXR on the growth inhibitory rates

　　of the hepatoma cells (±s， n=6)

　　*P＜0.01, vs control; LE: live extract; DXR: doxorbicin

　　(一)LE和DXR对移植肝癌组织生长的抑瘤率，见表1。

　　(二)LE和DXR对移植肝癌细胞有丝分裂的影响，见表2。

表2　LE和DXR对裸小鼠肝癌细胞有丝分裂的影响

　　Tab 2 Effect of LE and DXR on the mitosis of

　　the hepatoma cells (MI, ±s,n=6)

　　*P＜0.05,vs control

　　(三) 对移植肝癌细胞凋亡的影响见表3。

表3　LE和DXR对裸小鼠肝癌细胞凋亡标记指数的影响

　　Tab 3 Effect of LE and DXR on the apoptotic label index of

　　the hepatoma cells (LI, ±s, n=6)

　　*P＜0.01, vs control

Fig.1　Morphological observation of the hepatoma cells transplanted in nude mice

　　control group(1A),liver extract group(1B),doxorubicin group(1C),stained by H.E.×400

1　裸小鼠肾包膜下移植BEL-7402肝癌细胞的形态学观察

Fig.2　Apoptotic ceklls morphology of the hepatoma cells transplanted in nude mice

　　control group(2A),liver extract group(2B),doxorubicin group(2C);(↑)apoptotic cells

　　,stained by in situ TUNEL apoptotic cells detecition,restained by methylgreen×400

2　裸小鼠肾包膜下移植肝癌细胞的凋亡细胞形态学观察

　　讨　　论

　　孔祥平等^［4］在研究促肝细胞生长素(promoting hepatomacyte growth factor, pHGF)的过程中发现，pHGF能抑制皮下接种的骨髓瘤SP²／O细胞和BEL-7402细胞的生长，在体外对多株肝癌细胞有明显的抑制作用^［1］。为此，孔祥平等^［2，3］曾对pHGF进行了分离纯化，发现pHGF中既含有促进正常肝细胞生长的活性物质，也有促进肝癌细胞凋亡的活性物质，并将这种物质更名为LE。进一步的研究发现，肝提取物中的凋亡组分经激光飞行时间质谱测定分子量为4.02 kD，高效液相色谱呈单一组份峰。

　　本实验结果表明，LE和DXR能明显抑制裸小鼠肾包膜接种的7402肝癌细胞移植瘤块的生长，抑瘤率分别为62.67%和106.80%(表1)。原位细胞凋亡检测表明，LE和DXR能明显促进7402肝癌细胞的凋亡(表3)。有丝分裂计数的结果显示，LE对肝癌细胞有丝分裂的影响不明显，提示LE对裸小鼠移植肝癌细胞的生长抑制是通过透导肝癌细胞凋亡而引起，并非直接抑制肝癌细胞增殖分裂所致，而DXR能明显抑制肝癌细胞的增殖(表2)。

　　孔祥平等^［2，3］用DNA梯状电泳，细胞形态学观察，原位细胞凋亡检测和流式细胞术从体外细胞培养证实纯化的LE能诱导肝癌细胞凋亡，这种凋亡诱导是通过介导癌基因表达而进行的。本实验研究结果表明，LE可以诱导裸小鼠移植的BEL-7402细胞凋亡增加，电镜下可见肝癌细胞核染色质边集，浓缩，核固缩增加，细胞间隙减少，伪足缩短，而对粗面内质网、线粒体以及细胞连接的结构影响不明显(图3B)。提示LE对移植肝癌细胞的生长抑制是直接诱导凋亡，而对肝癌细胞的异形性和细胞分化影响不明显。

　　DXR除了能促进肝癌细胞凋亡外，还能促进其分化。光镜结果显示，其细胞呈多角型，排列较规则，呈条索状；核染色较对照组和LE组浅且较规则，胞质比例增加且染色较浅红(图1C)；电镜结果显示，DXR能促进肝癌细胞内细胞器和细胞连接的发育和分化(图3C)。文献报道DXR能促进肝癌细胞凋亡^［5，6］，作用机制主要有：①与细胞DNA嵌合，干扰细胞DNA和RNA合成。②在体内形成自由基杀伤肿瘤细胞。③与细胞膜结合直接杀伤细胞。本研究发现，DXR能抑制肝癌细胞增殖和促进其凋亡，并且能促进其分化。

　　获军队科技进步二等奖

　　［参　考　文　献］

　　［1］　简志翰，Kren Li, 张宜俊，等. 促肝细胞生长素(pHGF)对六种人癌细胞株的抑制作用及诱导HL-60白血细胞凋亡［J］. 临床肝胆病杂志， 1995， 11(1)增刊：20～28.

　　［2］　孔祥平，邹清雁， 杨联萍，等. 肝提取物对正常肝和肝癌细胞作用的影响［J］. 上海免疫学杂志，1997， 17(2)：108～111.

　　［3］　孔祥平，邹清雁，杨联萍，等. 肝提取物对肝癌细胞(BEL-7402)凋亡相关基因表达的影响［J］. 中国病理生理杂志，1997， 13(6)： 570～573.

　　［4］　孔祥平，杨联萍，邹清雁，等. 促肝细胞生长素对小鼠移植肿瘤的实验研究［J］. 临床肝胆病杂志，1995， 11(1)增刊：46～48.

　　［5］　张晓东，王文亮. 阿霉素诱导人肝癌细胞凋亡模型的建立［J］. 中华肿瘤杂志，1997， 19(4)： 260～263.

　　［6］　杨秀疆，宝建中，陈士葆，等. HGF介导DXR诱导肝癌细胞的凋亡作用［J］. 肿瘤防治研究，1998， 25(5)： 332～335.

　［收稿日期］ 2000-04-06

　　［修回日期］ 2000-05-26