茶多酚、茶色素对肝癌癌前病变大鼠肝脏Ⅱ相解毒酶的诱导及其在化学预防中的作用

卫生研究 2000年第3期第29卷 达能营养中心青年科学工作者论坛

作者：宫芸芸　韩　驰　陈君石

单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京　100050

关键词：茶多酚；茶色素；谷胱甘肽硫转移酶；癌前病变

　　摘要：以二乙基亚硝胺(DEN)启动、切除部分肝组织和腹腔注射CCl₄(PH/CCl₄)促进联合作用造成大鼠肝癌癌前病变模型，试验组除上述处理外饮用0.1%的茶多酚或茶色素，8周后宰杀，测定肝细胞浆谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性，用GST1-1、1-2、3-3、Pi多克隆抗体Western Blotting方法检测GST各亚型蛋白质的相对水平。研究发现茶多酚或茶色素可使DEN/PH/CCl₄组动物的GST活性降低有明显的回升；主要表现为茶多酚、茶色素对GST1-1、1-2、3-3都有不同程度的诱导，由于GST1-1、GST1-2属于GSTα类，GST3-3则属GSTμ类，因此茶多酚主要诱导GST α，而茶色素则主要诱导GST μ。而对GST-Pi有明显的抑制作用。本研究表明，茶多酚和茶色素都能通过有效调节大鼠体内Ⅱ相代谢酶，从而抑制DEN诱发的大鼠癌前病变的发生和发展。

　　中图分类号：TS272.5　R730.1　R735.7　　　　文献标识码：A

　　文章编号：1000-8020(2000)03-0159-03

Effect of tea polyphenols and tea pigments on inducing

　　the chemoprevention of liver precancerous lesions

Gong Yunyun, Han Chi, Chen Junshi

　　(Institute of Nutrition and Food Hygiene, Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China)

　　Abstract：In order to elucidate the chemoprevention mechanism of tea, the regulative effect of tea polyphenols and tea pigments on phase Ⅱ enzyme, glutathions S-transferase(GST)activity and its isoenzymes in Wistar rat were studied.Rat liver precancerous lesions were initiated with diethylnitrosamine (DEN),promoted with partial hepatectomy and carbon tetrachloride.The rats were killed after 8 weeks of treatment. Liver cytosol GST activities were tested.The GST 1-1,1-2,3-3 and Pi isoenzymes were detected with Western Blot method.The results showed that the activities of GST increased greatly in the tea polyphenol and tea pigment groups,while the activities were decreased in positive control group.Both tea polyphenold and tea pigments increased the activities of classes GST α(GST1-1,1-2)and GST μ(GST3-3).The increase of GST α was more in tea polyphenol group, and the increase of GST μ was more in tea pigment group.Both tea polyphenols and tea pigments inhibited the over expression of GST Pi in the rats treated with DEN/PH/CCl₄.The study indicated that tea polyphenols and tea pigments modulated phase Ⅱ enzymes effectively,thus inhibited the occurrence and development of the precancerous lesions of rat liver.

　　Key words:tea polyphenols, tea pigments, glutathione S-transferase, precancerous lesion

　　肝脏中含有丰富的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶，是外来物质代谢、转化的主要场所。前致癌物在肝脏经过Ⅰ相酶的氧化、还原反应代谢成为亲电性的终致癌物，攻击DNA而引起DNA损伤，Ⅱ相酶则催化亲电性外来物的结合反应，形成易于排出的代谢产物，可促进致癌物的体内代谢，阻断或抑制癌症发展进程，Ⅱ相代谢酶的诱导在外来物的解毒作用中至关重要。研究Ⅱ相解毒酶水平能为化学预防剂的防癌机制作出解释，因此在化学预防研究领域中，对Ⅱ相酶诱导剂的研究具有现实意义^［1］。

　　谷胱甘肽硫转移酶(GST)有抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的特点，GST有复杂的同工酶家族，不同亚型催化的反应各不相同，决定其作用的多样性。研究表明许多化学预防剂均对GST有明显的诱导作用。近来随着研究方法的发展和特异性抗体的发现，开始了对GST亚型的研究，由于不同亚型反映机体对不同化学物质的解毒代谢能力，有助于进一步了解化学预防剂作用机制及效果的特异性^［2］。

　　已有充分依据证明茶叶有防癌效果，茶叶防癌研究已从效果深入至机理方面，本文采用大鼠肝癌癌前病变模型，用分子生物学的研究手段，结合酶学研究，对红茶和绿茶中的有效成分——茶色素和茶多酚对癌前病变大鼠肝脏GST活性及其亚型的影响进行探讨，为阐明茶叶防癌机制提供有力依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　茶多酚、茶色素由浙江省茶叶科学研究所研制并提供。茶多酚纯度40%，茶色素为40%茶多酚的氧化后产物。二乙基亚硝胺(DEN)、1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)、还原性谷胱甘肽(GSH)、丙烯酰胺、亚甲基丙烯酰胺、NBT、BCIP均为Sigma产品。GST1-1、1-2、3-3、P的兔抗鼠多克隆抗体由日本Hirosaki大学医学院的Dr.Kimihiko Satoh惠赠。碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗为Bio-Red公司产品。分子量标志物(marker)为Promega公司产品，中等分子量范围。

　　1.2　动物模型^［3］

　　雄性Wistar大鼠，体重80～100g，由中国医学科学院动物繁育场提供。随机分为4组，适应性喂养3天后开始实验。阳性对照组(PC)自第7天起，连续6天每日经腹腔注射DEN 10mg/kg BW，于实验第40、41天分别经腹腔注射20% CCl₄0.5ml，第42天切除2/3肝叶，缝合伤口并继续喂养至第56天，断头宰杀；茶多酚阳性组(DFP)及茶色素阳性组(SSP)全程分别饮用0.1%茶多酚或0.1%茶色素；阴性对照组(NC)以常备饲料和自来水喂养。

　　1.3　组织处理

　　肝脏组织加4倍体积的预冷的0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.4)，匀浆后9000g离心15分钟，上清液再105000g离心1小时，用双缩脲法测上清蛋白含量，分装后-80℃保存或进行测定。

　　1.4　胞浆GST活性测定

　　按Habig方法以GSH和CDNB为底物^［4］。

　　1.5　GST亚型的免疫印迹测定(Western Blot)^［5］

　　将30μg胞浆蛋白变性后以SDS-Page分离蛋白，电转至硝酸纤维素膜，脱脂奶封闭后，依次于特异性GST亚型多克隆抗体、碱性磷酸酶(AP)标记二抗中孵育后，NBT/BCIP显色。用Shimadzu Dual-wavelength flying-spot Scanner CS-9000分析仪扫描定量。GST亚型有GST1-1、GST1-2、GST3-3、GST-P四种，其抗体稀释度为1∶1500，AP标记二抗稀释度为1∶3000。

　　1.6　统计分析

　　t检验分析各组间差异。对免疫印迹结果则计算各组的相对升高水平后再进行比较。

　　2　结果

　　2.1　动物体重和饮水量

　　试验期各组的饮茶水量没有明显差别；体重变化从第6周肝切除手术后，各手术组体重均较未手术组降低，以阳性对照组体重最低，与阴性对照组有显著差异。

图1　动物体重生长曲线

　　2.2　茶多酚和茶色素对肝癌癌前病变大鼠肝脏胞浆GST活性的诱导作用

　　在DEN/CCl₄/PH造成的肝癌癌前病变模型中，与阴性对照组相比，阳性对照组肝脏GST活性明显下降，茶多酚或茶色素组大鼠GST酶活性有明显回升，茶多酚组的升高水平尤为显著，茶多酚和茶色素组的GST活性都与阴性对照组无显著差别(P＞0.05)，见表1。

表1　茶多酚、茶色素对肝癌癌前病变大

　　鼠肝脏胞浆GST活性的影响(±s,n=12)

　　注：与阳性对照组相比，(1)P＜0.052.3　茶多酚、茶色素对大鼠肝脏GST亚型的影响

　　相对定量分析结果如表2、3。阳性对照组与阴性对照组的GST1-1、GST3-3相对水平相当；而阳性对照组的GST1-2的相对水平明显下降。茶多酚和茶色素GST1-1的作用相当，而茶多酚对GST1-2的诱导较为明显，茶色素对GST3-3的诱导作用更强。

表2　茶多酚、茶色素对肝癌癌前病变大鼠肝脏组织胞浆GST1-1、1-2、3-3亚型相对水平的影响(±s，n=6)

　　注：与阳性对照组相比，(1)P＜0.05　(2)P＜0.01　　Western Blot分析结果(表3)显示阳性组的GST-Pi有极显著的升高(P＜0.01)。饮0.1%茶多酚或茶色素动物的GST-Pi蛋白水平比阳性对照组下降。这一结果与以往对GST-Pi阳性灶的免疫组经实验结果的抑制率接近。

表3　茶多酚、茶色素对肝癌癌前病变大鼠肝脏组织

　　胞浆GST-Pi蛋白相对水平的影响(±s,n=6)

　　注：与阳性对照组相比，(1) P＜0.05　(2)P＜0.013　讨论

　　苯并芘经微粒代谢后的产物1，6/3，6-醌苯并芘可进一步由纯化的大鼠GST1-2所催化，而GST3-3则无催化作用。对黄曲霉毒素B₁来讲，大鼠肝脏的GST1-1、3-3亚型能特异性催化其代谢，但正常机体内的含量不足以使其亲电性代谢产物解毒，研究发现经抗氧化剂诱导可产生足够量的酶亚型，明显提高解毒能力，预防肝癌发生^［6］。

　　本研究结果表明，饮用茶多酚、茶色素动物的肝脏GST活性都明显高于阳性对照组，以茶多酚组的升高尤为明显。茶多酚或茶色素对GST1-1、GST1-2、GST3-3都有明显的诱导作用，但在GST各亚型间诱导水平有所不同，其中茶多酚对GST1-2的诱导作用较强，茶色素对GST3-3的诱导作用较强；而两者对GST1-1的诱导程度相当。GST1-1、GST1-2都属于GST α，GST3-3则属GST μ。因此说明茶多酚对GST α的诱导作用较强，而茶色素则偏重于对GST μ的诱导。GST α主要对氢过氧化物有较高的亲和力，其特征性的反应为不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GST-Px)活性，因此它对于清除过氧化产物有重要意义^［7］；而GST μ对环氧化物有很高的亲和力。另有研究表明GST μ参与对烷化剂的去硝基反应，有利于DEN的解毒、排出^［8］。因此，茶多酚、茶色素对GST α和GST μ的诱导能清除脂质过氧化产物，提高对环氧化物的解毒能力，从而减少致癌物及其中间活性产物、氢过氧化物等对机体的损伤。本研究结果表明，茶多酚发挥抗脂质过氧化损伤作用较大，而茶色素对DEN等致癌物的解毒作用稍强。

　　本研究还观察到茶多酚、茶色素对肝癌癌前病变细胞中高度表达的GST-Pi有特异性的抑制作用。而我们在免疫组化实验中也见到茶多酚、茶色素对GST-Pi阳性细胞和阳性灶的数目和面积有抑制作用。由于GST-Pi在不同种属的多种脏器肿瘤或癌前病变中均有高表达，而在正常大鼠肝组织中极少表达，目前已普遍认可GST-Pi阳性灶作为动物肝癌癌前病变的标志^［9，10］，我们的研究还发现茶多酚、茶色素对正常大鼠GST-Pi无明显诱导作用，这提示茶多酚、茶色素对癌前病变大鼠GST-Pi的抑制作用可能与GST-Pi以外的其它因素有关，有研究表明癌前病变肝脏GST-Pi的高表达是与癌基因的启动伴随发生的^［11］，报道的茶叶抑制癌变过程中的癌基因，可能正是这种抑制作用间接导致了GST-Pi水平下降，茶多酚、茶色素对该亚型表达水平的抑制可反映其对大鼠癌前病变有抑制作用，从而增强了茶叶防癌的证据。

　　基金项目：国家自然科学基金资助课题(No.39770650)

　　作者简介：宫芸芸，女，博士研究生

　　参考文献

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(1999-10-13收稿)