肝癌基因治疗的现状与展望
世界华人消化杂志 1998年第2期第0卷 文献综述
作者：何兴祥 王家 马龙
单位：同济医科大学肝病研究所 湖北省武汉市 430030
关键词：肝肿瘤/治疗；基因疗法；分子生物学
Subject headings liver neoplasms/therapy; gene therapy; molecular biology
中国图书资料分类号 R735.7
1 肿瘤基因治疗的策略
肿瘤基因治疗的最终目的是杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长使肿瘤消退.基本策略可归为三大类：①肿瘤免疫基因治疗：通过增强机体的特异和非特异性抗肿瘤免疫应答来控制肿瘤生长；②肿瘤遗传基因治疗：通过抑制肿瘤细胞的癌变基因的表达以治疗癌症；③肿瘤药物基因治疗：通过基因转移使肿瘤细胞对化疗的敏感性增加或者使正常细胞(如骨髓细胞)对化疗药物的耐受性增加来治疗肿瘤.
1.1 肿瘤免疫基因治疗 ①针对免疫应答细胞的治疗：用细胞因子基因转染抗癌免疫应答细胞(如TIL、CTL)可增加其抗癌活性，可供选择的目的基因有白介素(IL-1、2、4、6、12等)、干扰素(IFNα和β等)、TNF、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF)等. rosenberg et al［1］将TNFα基因导入带有标记基因(NeoR基因)的TIL细胞中，使TIL的杀瘤活性大为增强，目前该方案已用于临床试验［1］.②针对肿瘤细胞的治疗：肿瘤之所以能逃避机体的免疫防御系统，其可能原因是：(a)肿瘤没有表达特异抗原或有抗原但缺乏免疫原性；(b)有些肿瘤能表达特异性抗原但缺乏主要组织相容性复合体(MHC)抗原；(c)缺乏B7分子的表达，因为近年来发现，T细胞的激活不但需要肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞受体(TCR)的结合，还需要另一“共同刺激”信号B7分子和T细胞膜上的CD28受体的结合才能完成［2］. michigan大学医学中心的Nabel获准以B7基因治疗若干名晚期黑色素瘤患者，用脂质体包裹B7基因直接行瘤体内注射，以期B7基因的整合表达能促进T细胞抗肿瘤免疫.用该方法治疗的5名Ⅳ期黑色素瘤患者的结果令人鼓舞，其中一名患者的远端肿瘤完全消退［3］.
1.2 肿瘤遗传基因治疗 ①针对癌基因的治疗：即通过反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, Oligos)技术干扰癌基因的转录和翻译，以关闭其表达.癌基因是一个大家族，已发现100余种，因此有多种目的基因可供选择.目前在临床上试用的Oligos主要有硫代磷酸寡核苷酸(MP.Oligos)［4］.美国Anderson癌症中心经FDA同意，进行首例Oligos治疗恶性肿瘤的临床研究［5］，其方案是取CML患者的白血病细胞以“净化骨髓”，同时给患者施行大剂量化疗和放疗以彻底杀灭体内的肿瘤细胞，再回输净化的自体骨髓.②针对抑癌基因的治疗：已确定的抑癌基因有DCC、NF1、NF2、RB、P53、WT1、FAP、VHL；新的抑癌基因的后选者有吴(曰)/(文)等1991年分离的RA538和Kaplan等1990年分离的RPTPaseγ.针对抑癌基因治疗的策略是恢复由于缺失或突变而丢失的抑癌基因的正常功能.临床前实验研究已取得肯定结果，如人野生型p53基因能抑制复发的T-ALL来源Be-13细胞的恶性表型［6］.但临床上的治疗试验开展甚少. 主要是针对这种“替代疗法”存在较大争议，例如以病毒载体导入抑癌基因p53，首先载体是否安全、，其次转导p53后对周围细胞有何影响等.③表达调控治疗：肿瘤的发病存在细胞周期调控基因的异常［7］，刘定干提出［8］通过人工使用药物，对细胞内的功能核酸3′或5′调控区进行控制，来实现基因治疗，而不是控制其编码区.目前正在试验的一些基因疗法是以杀灭癌细胞为目的，这和常规的手术切除肿瘤并无本质的区别，这些疗法均不能把甚至一个癌细胞变回到正常状态.但是，实践经验告诉我们，癌块周围的许多细胞已经偏离了正常状态.表达调控治疗的指导思想是把癌块周围的细胞和部分癌细胞的恶性度减弱，甚至变回到正常状态.
1.3 肿瘤的药物基因治疗 即将基因治疗技术与肿瘤化疗药物或药物前体结合起来有选择性杀伤肿瘤细胞和保护正常组织以增强化疗的效果.①“自杀”基因疗法：来自原核或低等生物的“自杀”基因(suicide gene)编码的酶类，能使一些药物前体转化而获得对哺乳动物细胞的毒性，并将这些基因导入肿瘤细胞，再伍用相应药物前体，可使肿瘤细胞因表达此类基因而“自杀”.已经发现的这类基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)基因、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(VZV-TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(CD)基因.“自杀”基因的应用是对传统化疗的重大改进在脑瘤的治疗中取得了重大进展，有广泛的发展前景.1992年6月，美国基因治疗公司(GTI)的Culver等经RAC同意，拟选择少数手术无法切除的脑瘤患者开展一项基因治疗计划.目的基因即为HSV-TK. 其一期临床研究的部分结果表明，VDEPT(virus directed enzyme prodrug therapy)治疗成人脑瘤有一定效果. 8例接受治疗的患者中5例产生应答，其中3例脑瘤萎缩，同时患者对治疗耐受性良好.②肿瘤药物增敏基因：这类基因的产物能使细胞对已有肿瘤化疗药物的敏感性增加.如钙调素基因(CaM)能增加肿瘤细胞对长春花碱类化疗药物的敏感性，降低耐药性，从而增加化疗的效果.③肿瘤药物耐受基因：将肿瘤药物耐受基因导入正常造血干细胞或祖细胞可增加其对化疗药物的耐受剂量，间接地提高化疗的效果.如通过向造血干细胞内导入二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，可使正常细胞获得对氨甲喋呤的耐受性［9］；又如通过导入多相耐药(MDR)基因，如MDR基因，可使正常细胞获得广泛的药物耐受性.这样就可在不损伤正常细胞的前提下，用大剂量化疗药物清除残留的肿瘤细胞.另外，集落刺激因子、促红细胞生成素、白介素等也能增强肿瘤患者骨髓耐受化疗的能力［10］.
2 肝癌分子生物学的研究
美国Barbacid小组最早从事肝癌基因研究，于1984年报道了在1例肝癌组织中有N-ras基因存在.李岱宗 et al［11］对肝癌癌基因谱做了较系统的深入研究，发现至少有7种癌基因：N-ras、C-myc、p53、,C-ets-2、C-fms、IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR的表达异常.对肝癌抑癌基因的研究报道结果不尽相同，但多数资料显示染色体8p、13q、16q和17p区域存在与肝癌发生和演进关系密切的肿瘤抑制基因.肝癌中常见p53基因突变，且多为第249密码子第3碱基G→T颠换［12］.肝癌中染色体13q缺失的最小重叠区域为13q14，在肝癌组织中还同时发现伴随等位基因丢失的存留RB1等位基因突变以及和RB1等位基因丢失高度相关的P110RB1蛋白丢失，提示RB1基因为肝癌的又一重要抑癌基因［13］.国内顾健人 et al［14］分离的转甲状腺素蛋白(TTR)基因也是肝癌新的抑癌基因的候选者.流行病学调查发现HBV、HCV与肝癌有关.
3 肝癌基因治疗的现状及存在的问题
肝癌的基因治疗尚处于动物实验阶段，报道的文献亦不多. neda et al［15］阐述了一种将逆转录病毒载体靶向导入肝细胞的方法，在该方法中，改变逆转录病毒载体表面，使它可与肝细胞表面的去唾液酸α1酸性糖蛋白受体结合.同时，Wu et al［16］也进行了受体介导的基因转移细胞靶向性的研究，他们针对肝细胞特异的去唾液酸α1酸性糖蛋白受体，构建了一种可溶性的分子复合物载体.在体内外实验中，利用这一分子复合物载体，均已将外源基因选择性地导入肝细胞，并检测到外源基因的表达，除了细胞靶向性外在位点靶向性方面也有报道，Huber et al［17］将α-FP基因表达调控片段与VZV-TK基因重组，构造了PCR74和PCR 78质粒两个载体，经逆转录病毒转染肝癌细胞和非肝癌细胞，只有肝癌细胞才专一性地合成TK，建立了VDEPT概念，VDEPT病毒可使VZV-TK基因在肝癌细胞内特异性地表达，用araM处理可选择性地杀伤肝癌细胞.
许秀兰 et al［18］首次报道了含人N-ras cDNA反义密码顺序的逆转录病毒对人肝癌细胞株PLC/PRF/5的生长有明显的抑制作用，并伴有ras基因表达产物下降.以后黄贤明 et al［19］又报道用C-ets-2、C-myc、N-ras三个癌基因联合反义RNA使人肝癌细胞株SMMC-7721的生长速率下降约70%，有进一步探索的价值.
傅青春 et al［20］进行了脂质体-白细胞介素-2基因复合物瘤体内注射治疗肝细胞癌的实验研究，结果表明，脂质体-IL-2基因复合物直接注射入瘤体后获局部IL-2基因表达，从而诱生了机体抗肿瘤效应，也为肝癌的基因治疗提供了一种简便实用的模式.
但是肝癌的基因治疗仍有许多问题亟待解决：①以肝癌细胞为基因转移的受体细胞的靶向性问题；②逆转录病毒载体的安全性问题；③肝癌是多个癌基因激活，多个抑癌基因失活，多个步骤癌变共同作用的结果.如以肿瘤遗传基因治疗，其先决条件是把治疗基因导入身体的所有肿瘤细胞中，目前尚没有一种基因导入系统能获得这样高的效率.④肝脏是重要的代谢场所，如何使导入的基因的产物只对肿瘤细胞起作用而不影响正常细胞等.
4 肝癌基因治疗的展望
通过对其他肿瘤治疗方法及肝癌发生发展分子遗传模式的研究，对肝癌的基因治疗提出以下设想.①在免疫基因治疗方面：可将一细胞因子基因如IFN-γ、IL-2、TNF、B7等导入自体肿瘤细胞或抗肿瘤效应细胞.在肝癌中，可构建肝癌中特异表达的系统来导入这些基因，以增强肿瘤细胞的免疫原性或导入一些基因到抗肿瘤应答细胞如TIL以增强应答细胞的杀瘤作用.②在遗传基因治疗方面：由于肝癌的发生发展是多种癌基因的激活和抑癌基因的失活.可望联合多个关键的癌基因反义寡核苷酸或抑癌基因导入肿瘤细胞，使癌细胞回复至正常状态.此外，寻找一些针对表达调控的信息分子也是很有前途的. ③在药物基因治疗方面：将基因治疗与化疗联合的方法，为目前研究的热点.例如Huber等构建的VZV-TK系统，对癌周组织及骨髓细胞的影响有待验证.另外在肝癌的基因治疗中，将MDR导入骨髓干细胞配合化疗也是值是探讨的.
总之，随着外源基因转导、表达技术的提高及细胞靶向性与位点靶向性载体的构建，恶性肿瘤的基因治疗将成为一种有前途的治疗方法.美国NIH的一位官员预言：在下一世纪，基因治疗将成为对付我们现在不能治愈疾病的主要治疗方法.
通讯作者 何兴祥收稿日期 1997-11-10
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