nm23-H1杂合性等位基因丢失与肝癌转移的关系

中华外科杂志 1998年第3期第36卷 临床研究

作者：叶颖江　余业勤　万大方　汤钊猷　陆继珍　贺丽萍

单位：上海医科大学肝癌研究所［叶颖江(现在北京医科大学人民医院普外科)、余业勤、汤钊猷、陆继珍］；上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室（万大方、贺丽萍）

关键词：癌，肝细胞；等位基因；肿瘤转移

　　【摘要】　目的　从DNA水平揭示nm23-H1杂合性基因丢失与人原发性肝癌肝内转移、门静脉形成癌栓等的临床病理特征的关系。方法　应用Southern印迹杂交技术，对25例肝癌及癌旁肝组织DNA进行分析。结果　nm23-H1两条等位基因分别为7.6Kb、2.3Kb，杂合性等位基因丢失率为31.25%(5／16)。nm23-H1杂合性基因丢失多见于分化较差的EdmondsonⅢ、Ⅳ级和伴肝内转移或门静脉形成癌栓的肝癌。结论　nm23-H1可能诱发肝细胞肝癌的转移潜能,有助于预测肝癌复发和转移。

　　The relationship between nm23-H1 loss of heterozygoisty and metastasis in hepatocellular carcinoma Ye Yingjiang^*, Yu Yeqin, Wan Dafang, et al.Liver Cancer Institute. Shanghai Medical University, Shanghai 200032.

　　【Abstract】　Objective　To demonstrate the relationship between nm23-H1 loss of heterozygoisty (LOH) and clinical pathological characteristics of hepatocellular carcinoma(HCC) from the DNA level.Method　Southern blot hybridization was used to analyze genomic DNA in liver cancer and its corresponding liver tissue.Result　nm23-H1 has diallelic bands at 7.6 Kb and 2.3 Kb.Allelic loss of heterozygoisty in tumour tissues was detected in 31.25% patients (5 patients).LOHs were more common in the tumours with intrahepatic metastasis or portal vein tumour emblus and the tumours poorly differentiated(Edmondson's classificasionⅢ、Ⅳ).Conclusion　nm23-H1 LOHs may induce the metastasis potential of HCC and help to predict recurrence and metastasis of HCC.

　　【Key words】　Carcinoma,hpatocellular 　　Alleles　　Neoplasm metastasis

　　nm23-H1是癌转移抑制基因，位于17号染色体的长臂^［1］，该基因的表达水平与某些肿瘤转移潜能呈负相关^［2～5］。我们的研究曾证实，nm23-H1

　　mRNA高表达能抑制肝细胞癌的转移^［6］。而作为抑癌基因的一个重要识别标志，已发现在部分人癌组织染色体中，nm23-H1基因的杂合性丢失(loss of heterozygoisty,LOH)^［7］。肝癌组织中有无该基因结构改变，尚不清楚。我们应用Southern印迹杂交技术，进一步探讨了肝癌nm23-H1基因LOH及其临床意义。

资料与方法

　　1．组织准备：25例肝癌及其癌旁肝组织的新鲜标本，取自上海医科大学肝癌研究所1995年3月到6月间，原发性肝癌住院手术的部分病例。病理证实为肝细胞癌。标本离体5～10 min内取材，液氮速冻，－70℃保存。

　　全部病例，男17例，女8例，肝肿瘤小于或等于5 cm者4例，大于5 cm者21例，HBsAg阳性21例，伴肝硬变肝癌19例。

　　2．cDNA探针的制备：参照文献报道设计一对引物^［8］；P1:5′-GGCTCGAGATCGCCAACTGTGA GC-3′，P2:5′-GGGCGGCCGCTCATTCATAGAT-

　　CCAGTTC-3′。以正常肝mRNA为模板，经过RT-PCR扩增目的片段(含nm23-H1全编码区)。以pBluescriptⅡ SK(-)为载体，构建nm23-H1 cDNA克隆，474个碱基组成的NotI,XhoI酶切片段作为探针。

　　3．基因组DNA的提取、酶切、转印：每例取－70℃冻存的癌及癌旁组织各约1g。研碎，蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提DNA。取每份DNA样品15 μg，Bgl Ⅱ(华美公司)消化，37℃2小时，1%琼脂糖凝胶分离DNA，碱变性后，转印DNA于硝酸纤维素膜上，80℃固定2小时。转印的硝酸纤维素膜置预杂交液中42℃过夜后，供杂交。

　　4．探针标记及杂交：探针标记采用α-32PdATP(amersham),按随机引物延伸标记法(multprime lablling system,amersham)。取预杂交的膜片，加入杂交液(50％甲酰胺，50×Dengardt溶液，0.1％焦磷酸钠，0.1%十二烷基磺酸钠，100 μg／ml变性鲑精DNA等)和变性的标记探针，在42℃恒温水浴摇床杂交24小时，分别用2×SSC，0.2%SDS，1×SSC，0.1％SDS洗膜。包片，放射自显影，置－50℃10天，洗片。

　　5．统计学处理：采用χ²检验或双边F精确检验方法。

结果

　　1．Southern杂交条带模式：所有DNA样品均有1条恒定的21 Kb条带。nm23-H1等位基因条带有两条，分别是7.6 Kb和2.3 Kb。25例患者中，16例（64%）DNA表现为杂合性等位基因，即包含7.6 Kb和2.3 Kb，这16例中，5例（31.2%）癌组织DNA出现1条等位基因丢失，1例丢失7.6 Kb，4例丢失2.3 Kb(附图)。9例（36％）患者DNA为纯合性，即只含1条等位基因，其中2例只含7.6 Kb，7例只含2.3 Kb。表现为纯合性的病例，癌组织无等位基因丢失(附图)。

nm23-H1等位基因杂和性丢失5例，2.3 Kb丢失(←)4例，7.6 Kb丢失(←)1例。T：肝细胞癌　L：癌旁肝

　　附图　Bgl Ⅱ基因组DNA Southern杂交、放射自显影

　　2．nm23-H1等位基因杂合性丢失与临床病理特征的关系：16例杂合性等位基因肝细胞癌患者的nm23-H1杂合性等位基因丢失频率为31.25%（5／16），这种丢失与肝内转移、门静脉形成癌栓有密切相关。9例分化较差的Edmondson Ⅲ、Ⅳ级癌，有5例(55.6%)存在杂合性丢失，7例分化较好的Edmondson Ⅰ、Ⅱ级肝细胞癌，无1例有LOH(P＜0.05)。71.4%(5／7)的伴肝内转移和(或)门静脉癌栓的肝细胞癌存在nm23-H1杂合性等位基因丢失，高于不伴肝内转移和／或门静脉癌栓肝癌LOH频率0%(0／9,P＜0.01)(附表)。

附表　16例nm23-H1杂合性基因患者LOH与肝癌临床病理特征的关系

　　P值＜0.05

　　nm23-H1基因杂合性丢失与患者年龄、性别、血清AFP浓度、HBsAg状态、包膜侵犯、肝硬变、TNM分期均无统计学差异。

讨论

　　肿瘤染色体杂合性等位基因的丢失是一较为常见的基因变异，也提示一种抗癌基因的存在。寻找肿瘤染色体常见的缺失位点是确定肿瘤抑制基因的重要途径^［9，10］。我们利用由正常肝组织mRNA制备的nm23-H1 cDNA探针，首次对肝癌及癌旁肝组织染色体DNA进行Southern印迹杂交，发现16例为杂合性个体，其中5例癌组织DNA存在一条等位基因丢失或其杂交信号较正常组织缺失50%以上，即杂合性丢失(LOH)，其丢失频率为31.25%。而在9例纯合性个体未见1例等位基因丢失。这说明作为癌转移抑制基因，nm23-H1基因在肝癌也容易发生杂合性丢失。Steeg研究108份四种癌组织标本，发现乳腺癌、非小细胞肺癌、伴转移的肾癌和浸润性结肠癌均有nm23-H1杂合性等位基因丢失^［7］。并且该基因LOH与转移相关。各种癌LOH频率的差异，可能与组织特性、不同发生机制有关。

　　我们也发现nm23-H1杂合性等位基因丢失，影响肝癌细胞分化和肝内转移、门静脉形成癌栓。分化较差的Ⅲ、Ⅳ级肝细胞癌，等位基因杂合性丢失率高于分化较好的Ⅰ、Ⅱ级肝癌。癌细胞在由高分化到低分化的过程中，其恶性程度逐渐增高，浸润和转移更广泛、迅速。这个过程可能由nm23-H1 LOH，抑制转移作用失活所致。Vell等研究发现，随卵巢癌组织分级由低到高，nm23-H1基因LOH频率逐渐增高^［11］。Yumoto等^［12］对肝癌17号染色体等位基因LOH分析也得出类似结论，肝细胞癌LOH更常见于进展期肿瘤，随癌细胞分化越差，组织学分级增高，等位基因LOH频率增加。

　　Wang等^［13］对结肠癌nm23-H1基因分析，揭示8例伴淋巴结转移、肺、肝转移的癌组织中，4例存在基因突变或等位基因丢失，另外12例无转移的结肠癌，无基因突变。在本研究中，nm23-H1杂合性等位基因丢失均发生于伴肝内转移和／或门静脉形成癌栓的肝癌，不伴转移和门静脉癌栓的肝癌无LOH。肝细胞癌肝内转移的出现，门静脉癌栓形成是预示肝癌晚期的重要临床特征。肝癌nm23-H1基因LOH，随转移的发生，逐渐增高，提示该基因LOH促进肝癌转移。

　　尽管本组结果显示nm23-H1基因LOH与TNM分期无关，但是在分化较差的原发性肝癌和伴肝内转移、门静脉癌栓的原发性肝癌，nm23-H1LOH发生频率高。而且在其它癌的研究发现，转移癌和原发癌有同一条等位基因丢失。

　　综上所述，随肝细胞癌进展，nm23-H1 LOH有累积趋势，其丢失频率在分化差和伴肝内转移、门静脉癌栓的肝癌中较高，对于手术切除肝癌组织，nm23-H1基因LOH检测可能有助于预测转移复发的高危患者，进行密切随访，以便及时治疗。

　　志谢　国家重点实验室顾建人院士和肝癌所吴志全教授、樊嘉副教授、周俭主治医师

参考文献

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　　11Viel A, Dall'Agnese L, Canzonieri V, et al. Suppressive role of the metastasis-related nm23-H1 gene in human ovarian carcinomas:association of high messenger RNA expression with lack of lymph node metastasis. Cancer Res,1995，55:2645-2650．

　　12Yumoto Y, Hanafusa T, Hada H, et al. Loss of heterozygosity and analysis of mutation p53 in human hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepat,1994，13:423-435.

　　13Wang LM, Patel U, Ghosh L, et al. Mutation in the nm23 gene is association with metastasis in colorectal cancer. Cancer Res,1993,53:717-720．

　　本课题受美国中华医学会基金和上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室基金的资助

　　（收稿：1997-01-15　修回：1997-12-25）