小鼠移植性肝癌(H₂₂)模型的研究及在中医药抗肿瘤中的应用

中国中医基础医学杂志 2000年第1期第6卷 实验研究

作者：李海燕　方肇勤　梁尚华

单位：李海燕（上海中医药大学中医基础学科中心实验室，上海　200032）　；方肇勤（上海中医药大学中医基础学科中心实验室，上海　200032）　；梁尚华（上海中医药大学中医基础学科中心实验室，上海　200032）

　　中图分类号：RT3-35　　文献标识码：B

　　文章编码：1006-3250(2000)01-0070-04

Research on the Model of Mice Hepatoma(H22) and Application of the Model

　　to Experimental Study of Traditional Chinese Medicine

LI Hai-yan　FANG Zao-qin

　　Abstract:The article tells systhetically the study of the model of mice hepatoma(H₂₂)biological,immunological characteristics,experimential methods,the establishment of cell lines,and the application of the model to anti-tumorous research of Traditional Chinese Medicine.So it is not difficult to see the model is a useful model in experimental study of liver cancer and screening of anticancer drugs.

　　H₂₂肿瘤瘤株属小鼠的肝细胞瘤，系1952年苏联医学科学院肿瘤研究院(莫斯科)用O-Ptoaminoazotolyol(OAAT)涂C₃H小鼠的皮肤100次后诱发，皮下传代的肝脏实体瘤。1963年中科院上海药物所引进后将肝脏实体型瘤株变成腹水型瘤株(其腹水型又称Hca,HAC或HepA)，并在Km小鼠腹腔常规保存。由国外引进后，曾有报道(1961年)该癌已转变为多形细胞肉瘤，丧失了原有的肝索样排列和多边性细胞的特点，但根据对H₂₂肿瘤腹水型细胞的观察，发现瘤细胞仍保持了上皮来源肿瘤的基本特征，且经过角蛋白单克隆抗体和肝脏特异性酶的检测，证明Hca瘤株及其亚系仍然保持了上皮组织的特征，变成了低分化肝癌。引进30多年来，国内研究者对其生物学特性、免疫学、细胞系的建立及移植实验条件等方面做了较为深入的研究。目前此模型已广泛地应用于肿瘤基础研究及药物筛选，成为研究中医药抗肿瘤的作用及机制的一个公认的肿瘤模型。

　　1　H₂₂的生物学特性

　　1.1　接种成功率

　　肿瘤移植条件采用BALB/C，Km，615和CFW 4种小鼠右腋中线皮下注入体外传代后第60代和第88代H₂₂瘤细胞(共60只)，生瘤率100%，无一例自发消退。同侧腋窝淋巴结转移率为0～10%^［1］。因小鼠腹水癌H₂₂是615小鼠同种不同品系的瘤株，若经过在615小鼠体内多次传代瘤型稳定后，接种于615系小鼠，远交系小鼠Km及其它5种近交系小鼠体内，移植率均为100%，这说明H₂₂可能是一个异基因癌株^［2］。

　　1.2　不同的接种途径研究

　　H₂₂瘤细胞接种于皮下呈结节状增长，移植于腹腔呈腹水型增长。如H₂₂-F₂₀瘤细胞可在615系小鼠的脚掌、腋下等多个部位移植生长，并形成不同程度的转移，且主要沿淋巴系统转移，其中脚掌组转移的范围最广泛，数目也较多。若小鼠H₂₂腹腔注射，则肿瘤细胞在腹腔生长，增殖时其早期晚期主要呈游离性生长，极少形成肿瘤结节和转移灶。

　　1.3　转移能力的比较

　　转移是恶性肿瘤细胞的基本生物学特征之一。从H₂₂和H₂₂-F₂₀瘤细胞(将H₂₂-F₀细胞种植入615小鼠脚掌皮下，取其淋巴结的转移瘤制成细胞悬液，再注入615小鼠腹腔，如此经体内淋巴系统筛选10次为H₂₂-F₁₀，筛选20次即为H₂₂-F₂₀)的肿瘤移植率和淋巴道转移率的比较结果发现，F₂₀瘤细胞生物学行为的恶性度高于H₂₂瘤细胞，所以两种瘤细胞虽然在615和Km两种品系的小鼠腹腔中均能较好地形成腹水，但二者在不同的小鼠体内淋巴结的转移率则有不同的结果^［3］。在比较H₂₂-F₀(该瘤株是将远交系Km小鼠腹水癌H₂₂细胞接种于615小鼠体内经过连续传代获得的稳定瘤株)与H₂₂-F₁₀的转移能力中发现，尽管二者转移的部位基本相同，但F₁₀比F₀转移能力增加，在多数部位淋巴结受侵犯的程度，F₁₀比F₀要严重得多。从两组动物生存天数看，F₀组为631d(44～93d)，F₁₀组为38.2d(32～46d)。提示F₁₀可能是从F₀细胞群体中筛选出来的高转移力的细胞亚群。

　　建立H₂₂实验性转移模型对研究H₂₂肿瘤本身及筛选控制癌转移的药物等方面的基础研究有很重要的意义。大连医学院利用615小鼠腹水癌接种于615系小鼠，远交系Km小鼠及其它5种近交系小鼠脚掌、腋下等，建立了淋巴道转移模型。这种小鼠腹水癌(H₂₂)实验性淋巴道转移模型是一个较适用的并符合自然转移规律的动物模型^［2］。同济医科大学利用昆明种小鼠尾静脉注射1ml(1×10⁶)H₂₂实体瘤瘤株的细胞悬液，3d后，形成H₂₂肝癌的肺转移模型。

　　2　H₂₂的免疫学特性

　　体外实验研究发现，H₂₂肿瘤细胞核糖核酸(TuRNA)可显著抑制脾淋巴细胞的细胞毒功能，效应具有明显的剂量依赖性。牛胰核糖核酸处理并不能消除H₂₂TuRNA的抑制效应，酶处理后样品的电泳图谱表明，具有抗RNase性质的4S左右的小分子是其抑制作用的效应成分之一。H₂₂TuRNA尚可抑制淋巴细胞的粘附能力，提示其可能通过影响淋巴细胞与靶细胞之间的相互接触而表现对淋巴细胞毒功能的抑制^［4］。

　　研究中又发现，从H₂₂实体瘤分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中未能诱导出对自身瘤细胞的细胞毒活性，多次实验重复结果一致，培养过程中瘤细胞不易消失。并在实验中，发现H₂₂能在无关品系的小鼠中生长，表明这些瘤株在体内已失去严格的MHC限制性。在利用单向混合淋巴细胞反应诱导同种抗原特异性T杀伤细胞对其杀伤活性检测结果表明，H₂₂可能不表达或表达很弱的MHC-1类分子。因此推测能否从某一恶性实体瘤中诱导出具细胞毒活性TIL与该瘤细胞表面是否表达正常水平的MHC-1类分子呈正相关^［5］。

　　在研究H₂₂和甲胎蛋白(AFP)的关系中发现，在体外，人AFP对小鼠H22腹水型肝癌细胞RNA的合成促进作用非常显著，认为人AFP与肝癌细胞上的特异性受体相互结合，导致癌细胞内代谢的一系列变化，进而引起癌细胞RNA合成速率的增加。也有研究者发现，从3～5个月龄引产胎儿肌肉组织中提取AFP，从转录水平观察AFP对小鼠H₂₂腹水型肝癌细胞RNA的合成有显著促进作用，人血白蛋白去AFP后，胎儿肌肉匀浆液等对照组无显著作用；AFP抗血清能显著清除AFP的这种促进作用^［6］。

　　3　细胞系的建立

　　由于接种小鼠品系及淋巴道转移能力的不同，研究者在体外建立了80320细胞系^［7］、H₂₂-F₀/L细胞系^［1］及H₂₂-F₂₅/L细胞系^［8］。80320细胞系是小鼠H₂₂肝癌腹水经小白鼠皮下注射后获得的肿瘤体外建系而成。其甲胎蛋白检验阳性，移植率为100%。H₂₂-F₁₀/L是未经淋巴道转移的小鼠H₂₂腹水肝癌细胞体外建系而成。其移植率为100%，同侧腋窝淋巴结转移率为0～10%。H₂₂-F₂₅/L是利用H₂₂腹水瘤细胞经615小鼠体内筛选(腹腔→脚垫→淋巴结→腹腔)25次后获得的瘤株体外建系而成。其移植率为100%，淋巴结转移率为50%，伴肺转移率为10%。

　　4　实验移植条件的探讨

　　H₂₂较容易在多种品系的小鼠体内移植，但在文献及实验中观察到接种相同癌细胞数的同一实验组内的小鼠移植肿瘤重量差异较大，变异系数(CV)高达90.93%。作者观察了3种振摇方式(水平直线、上下颠倒、旋转)，3个存放温度(37℃恒温箱中，27℃室温下，3℃冰盒中)和不同时间(10个时点)，发现选用水平直线振摇方式可使癌细胞在其悬液中分散比较均匀；存放条件应选用3℃，从抽取腹水时开始到移植完最后一只小鼠的总时间控制在2 h以内；小鼠移植顺序应依次从每组中抽取一只小鼠进行移植，结果观察到同一组内小鼠肿瘤重量变异系数下降为30%左右(15%～55%)^［9］。所以保持在移植过程中，活细胞分散均匀且数量稳定是肿瘤移植实验的一个关键。这不仅可大大提高小鼠肿瘤移植实验的成功率，也增加了其作为模型进行基础研究的可信度。

　　5　小鼠移植性肝癌(H₂₂)模型在中医药抗肿瘤中的应用

　　5.1　利用此模型研究中医药抗肝癌作用的机理

　　5.1.1　中药对肝癌细胞中的cAMP、cGMP含量的影响

　　cAMP、cGMP均为细胞内重要的第二信使，cAMP为细胞生长负反馈调节信使，可控制细胞增殖，促进细胞分化；cGMP则为细胞生长的正反馈调节信使，可抑制细胞分化，促进细胞增殖。观察中药复方龙葵注射液对肝癌(H₂₂)细胞的影响时，发现本药对肝癌(H₂₂)腹水型癌细胞的增殖有明显的抑制作用。同时观察到癌细胞膜表面上的cAMP-磷酸二脂酶(cAMP-PDE)和(Na⁺-K⁺)-ATP酶的活性明显下降，膜表面上的微绒毛明显消退。实验结果说明，其抗癌机理可能是通过抑制膜表面的cAMP-PDE和(Na⁺-K⁺)-ATP酶活性以提高cAMP水平，调控细胞的增殖和分化^［10］。在中药奈特液对H₂₂荷瘤小鼠cAMP、cGMP含量影响的研究中，观察到用药组肝脏及肿瘤组织内cAMP比肿瘤对照组均明显升高，而cGMP含量则显著降低，说明此药可促进癌细胞发生逆转，产生抗癌效应^［11］。

　　5.1.2　对肝癌细胞的DNA、RNA的合成及细胞周期的影响

　　研究中观察到，重楼总皂甙体内体外均能阻止癌细胞DNA，RNA的形成，干扰其物质代谢，这可能是其延长H₂₂动物肿瘤倍增时间，降低瘤重及瘤细胞数的原因之一。又发现丹参酮抗小鼠肝癌的作用，可能与抑制肿瘤细胞DNA的合成，增殖细胞核抗原(PCNA)表达及DNA多聚酶δ活性有关^［12］。中药亦对小鼠H₂₂腹水肝癌细胞周期有影响，如黄蘑多糖抗肝癌作用机制之一，是对H₂₂细胞周期中的两个关键点，即在G0/G1→S和G₂+M→G₀/G₁两个水平上抑制了H₂₂细胞的生长增殖。又如红景天素可抑制体外培养肝癌细胞于S期。

　　5.1.3　对荷瘤小鼠免疫功能的影响

　　在体实验表明，小鼠腋窝皮下接种H₂₂瘤细胞后，荷瘤小鼠脾脏、胸腺重量，脾细胞³-uR掺入cpm值下降，单核巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF)显著减少，自然杀伤细胞活性、IL-2活性明显下降，但移植瘤细胞中³H-uR掺入cm值显著升高。中药安替可胶囊抗瘤的作用机理，可能就与其刺激机体释放抗肿瘤细胞因子(如TNF、NKC和IL-2)，以及增强清除自由基(O^·₂和H₂O₂)的活性等有关^［13］。在钱氏抗肝癌方实验研究中，观察到其可抑制H₂₂实体瘤的生长，增加荷瘤小鼠白细胞，对荷瘤小鼠脾脏、胸腺重量无影响。在中药消结灵抗小鼠肝癌细胞机理的实验研究中发现其可激活淋巴细胞增生，增强淋巴细胞和枯否细胞的活性，分泌免疫调节因子以破坏癌细胞。

　　5.2　与其它小鼠肿瘤模型联合应用研究中药抗肿瘤的作用及中药对抗癌西药的减毒与增效作用

　　动物移植性肿瘤模型是目前抗瘤药物研究的重要方法之一。小鼠肝癌(H₂₂)模型作为一重要的肿瘤移植性模型，常与其它小鼠肿瘤移植性模型联合应用。如它常与小鼠肉瘤S₁₈₀模型等联合应用于中药抗肿瘤的作用及机理的研究中^［14］，亦和小鼠肉瘤S₁₈₀模型，小鼠肺癌Lewis模型等联合应用于中药对抗癌西药的减毒与增效作用的研究中，发现中药对化疗药物引起的骨髓有丝分裂抑制有一定的拮抗作用，能降低骨髓细胞的姐妹染色单体交换(SCE)效应，能拮抗化疗药引起的小鼠白细胞、淋巴细胞和骨髓有核细胞数量的减少，免疫器官萎缩，巨噬细胞吞噬功能的降低，并能显著提高自然杀伤细胞活性，说明中药不仅是一种有效的肿瘤化疗药物增效剂，而且能提高机体免疫功能，显著降低化疗药物的毒副作用^［15］。

　　综上所述，小鼠移植型肝癌(H₂₂)模型目前较为广泛地应用于肿瘤的基础研究中，其造模时间短、接种成功率高的特点，为研究者提供了较为方便的实验条件。但建议在运用的过程中，仍要不断对其生物学特性进行研究，以确保其作为肝癌模型的可靠性。

　　作者简介：李海燕，女(汉族)，河北邯郸人，上海中医药大学硕士生，从事不同治法对肝癌治疗机理的比较研究。

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收稿日期：1999-06-25

　　修回日期：1999-08-26