核酶体外切割肝癌多药耐药基因的研究
江苏医药 2000年第1期第26卷 基础研究
作者：刘顺英 孙宁
单位：刘顺英（210009 南京铁道医学院附属医院消化科）； 孙宁（210009 南京铁道医学院附属医院消化科）
关键词：多药耐药基因；核酶；基因克隆；逆转录-聚合酶链反应；SmaⅠ持续连接技术
摘 要：目的 利用核酶技术切割肿瘤多药耐药基因（MDR1），逆转肿瘤抗药性。方法 针对人类MDR1mRNA第VⅡ外显子附近第179及196密码子的GUC序列，按照“锤头结构”模型设计、合成了两个核酶179MDR1 Ribozyme（179RZ）和196MDR1 Ribozyme（196RZ），并定向克隆入载体PGEM-3Zf（＋）中。从肝癌多药耐药细胞株SMMC－7721／DOX中提取MDR1mRNA，RT－PCR法扩增出约269bp大小的特异性cDNA片段，采用SmaRT法克隆入载体PGEM－3Zf（＋）中。在体外转录成RNA。结果 通过测序证实重组质粒插入片断正确，在生理条件下，两个核酶均能定点切割MDR1mRNA成两段特定大小的片段。核酶的切割效率与作用时间、核酶与底物的比率、Mg2＋浓度有关，196RZ的切割活性高于179RZ。结论 核酶技术逆转肿瘤抗药性具有现实可能性。
Cleavage of human MDR1 mRNA by hammerhead ribozymes
LIU Shunying，SUN Ning
（Affiliated Hospital of Nanjing Railway Medical College，Nanjing 210009）
Abstract：Objective To reverse P-glycoprotein-mediated drug resistance specifically． Method we designed two hammerhead ribozymes which can cleave the GUC sequence in codon 179 and 196 of MDR1（PGY1） mRNA．A target MDR1 mRNA， around the codon 185 which codes for an amino acid residue possibly influencing the drug binding function of the P-gp，was created by a reverse transcription polymerase chain reaction using a SMMC-7721 human hepatic carcinoma cell line resistant to Doxorubicin（SMMC-7721／DOX），which displayed MDE1 overexpression．The MDR1 cDNA was then cloned by SmaⅠ Re-ligation Technique（sma-RT）． Results In a cellfree system，both ribozymes cleaved a target piece of MDR1 mRNA into two fragments at the specific site at physiological pH and temperature．The cleavage reaction was dependent on ribozyme：substrate ratio， incubation time and Mg2＋ion．The 196 MDR1 ribozyme was more active than the 179 MDR1 ribozyme． Conclusion The results show that ribozymes may inactivate MDR1 mRNA and revert the multidrug resistance phenotype because of their simple structure，site-specific cleavage activity and catalytic potential．
Key Words：MDR1 Ribozyme Gene cloning RT-PCR Sma-RT▲
多药耐药（multidrug resistance，MDR）的一个重要机制是多药耐药基因（MDR1）及其编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的扩增和过度表达［1］。P-gp是一种ATP依赖跨膜药物外流泵，研究MDR多在信使核糖核酸（mRNA）和蛋白质水平［2］。核酶（Ribozyme，RZ）是可作用于靶mRNA的具有催化活性的RNA，Haseloff等提出了“锤头结构”模型［3］并利用锤头状核酶在体外或细胞内特异性切割mRNA，阻断基因的表达。MDR-1 mRNA第Ⅶ外显子中第185密码子被认为是编码影响药物结合位点的氨基酸残基，对P-gp的功能非常重要［4］，而其上、下游不远处的第179或196密码子上存在GUC序列。利用核酶能特异性识别并切割GUC序列的特性，本文把针对MDR1 mRNA第179及196密码子的GUC序列的核酶互补cDNA定向克隆到载体中并体外转录成Ribozyme。此外，还把含185密码子的269bp长的MDR1 cDNA片段克隆到载体中作为探针，体外转录为MDR1 mRNA，用以检测并比较两个核酶的切割活性。
材料与方法
一、材料
1．试剂：TaqDNA聚合酶、SmaⅠ、Klenow酶、载体质粒PGEM－3Zf（＋）、体外转录试剂盒购自Promega公司，X-gal、IPTG、dNTP、DEPC、RNasin、M-MLV逆转录酶及T7、SP6通用引物均购自Sangon公司，T4DNA连接酶、限制性内切酶（Xbal、HindⅢ、BamHⅠ、Pst1等）购自MBI公司及华美生物工程公司，RNA提取液（TriPureTM Isolation Reagent）购自宝灵曼公司。
2．人肝癌多药耐药细胞株SMMC-7721／DOX本实验室诱导建立［5］。
3．主要仪器：PCR仪、冷冻离心机、恒温摇床、DYYⅡ微型电泳仪、凝胶成像处理系统等。
二、方法
（一）核酶重组质粒（P-RZ）的构建
1．核酶的设计、合成：参照Symons和Haseloff等提出的原则，用计算机软件辅助设计。
2．载体的制备：用Xbal、HindⅢ对载体质粒PGEM-3Zf（＋）进行双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳并回收3.1kb的质粒DNA片断。
3．重组质粒的克隆：先将A、B等摩尔比混合，C、D等摩尔比混合，98℃10min→75℃30min，缓慢退火至4℃；然后将载体DNA与A、B退火混合物及C、D退火混合物14℃连接过夜；连接混合物转化高效感受态细胞E．coli DH5α，用氨苄青霉素筛选出转化子。
4．克隆鉴定：涂平皿37℃过夜，挑出白色菌落，进行菌落PCR扩增，引物为T7、SP6。SSCP-银染技术筛选出重组质粒，进一步用Xbal、HindⅢ、Pstl等多种酶切鉴定，以确保扩增片断为外源插入的DNA序列。P-RZ送生物公司测序。
（二）MDR1 cDNA的克隆（SmaRT法）
1．取人肝癌多药耐药细胞株SMMC-7721／DOX，用异硫氰酸胍一步法提取总RNA。
2．RT-PCR
①引物设计：上游引物为：5’-GGTTGCTGCTTACATTCAGG-3’；
下游引物为：5’-GGGTTAGCTTCCAACCACG-3’。
②逆转录RNA合成互补cDNA：20μl反应体系中含10μg总RNA，4μl5×buffer，1μl10mMdNTP，1μlM-MLV逆转录酶，20URNasin，20pMol下游引物，42℃60min，95℃5min放入-70℃备用。
③PCR反应：总体积100μl，94℃40s，60℃45s，72℃1min，扩增35个循环后72℃再延伸5min。
3．SmaRT法克隆出重组质粒（P-MDR1）：SmaⅠ酶线性化载体，用Klenow酶3’末端补平的PCR产物与载体连接，连接混合物转化高效感受态细胞E．coli DH5α，用氨苄青霉素筛选出转化子。
4．克隆鉴定：菌落PCR、SSCP-银染技术筛选出重组质粒（P-MDR1），送生物公司测序。
（三）核酶切割活性的鉴定
1．分别用HindⅢ、BamHⅠ线性化重组质粒P-RZ及P-MDR1。
2．用Riboprobe○ R System-T7体外转录为RNA，100μl转录反应混合物含约5μg线性化质粒模板DNA，40U T7 RNA聚合酶，40mM Tris-HCl，PH7.9，6mM MgCl2，10mM NaCl，2mM亚精胺，10mM DTT，0.5mM ATP、GTP、CTP和UTP，以及1U／μl重组体核酸酶抑制剂。37℃反应2h。
3．体外切割反应：RZ和底物RNA于95℃加热2分钟，迅速放置冰浴中，然后混合于10μl反应体积中，37℃孵育，分别改变孵育时间、RZ：substrate的比率、Mg2＋浓度进行反应，加入同体积的终止液（95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴芬蓝，0.05％二甲苯青）终止反应。
4．SSCP-银染技术：用含7M尿素的6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测切割反应结果。
结果
一、核酶重组质粒的克隆结果
核酶重组质粒的DNA测序结果证实插入片段序列与设计的一致，见图1。
图1 质粒的酶切结果
a、b、c为分别用Pst1、Xbal、HindⅢ酶切PGEM-3zf（＋）
d、e、f为分别用Pst1、Xbal、HindⅢ酶切P-179RZ
g、h、i为分别用Pstl、Xbal、HindⅢ酶切P-196RZ
j为λDNA／EcoRI＋HindⅢ分子量Marker
二、MDR1 cDNA的克隆结果
重组质粒P-MDR1的DNA测序结果与基因文库中提供的MDR1mRNA序列对照，证实插入的PCR产物序列是正确的，见图2。
三、核酶切割活性检测结果
在生理条件下，两个核酶均能定点切割MDR1mRNA成两段特定大小的片段。核酶的切割效率与作用时间、核酶与底物的比率、Mg2＋浓度成正比。
图2 RT-PCR产物与菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果
①、B10为PCR Marker；②为RT-PCR产物；③～⑤以PGEM-3zf（＋）为模板进行扩增；③用上、下游引物扩增；④用T7、下游引物扩增；⑤用T7、上游引物扩增；⑥～⑨以P-MDR1为模板进行扩增；⑥用上、下游引物扩增；⑦用T7、下游引物扩增；⑧用T7、上游引物扩增；⑨用T7、SP6引物扩增。讨论
一、MDR1 cDNA的克隆
本实验采用的SmaRT（SmaⅠ Re-ligation Technique，SmaⅠ持续连接技术）是一种操作方便、步骤简单的PCR产物直接克隆技术，它不需设计酶切位点，不需要纯化PCR产物，不需磷酸化与长度选择。在本实验方法中，线性化载体不去磷，PCR产物也不加磷，不可能出现PCR产物多聚体与载体相连接的情况，使得用菌落PCR方法直接鉴定重组子成为可能，也更为方便。
二、核酶的设计
核酶与靶RNA之间碱基配对长度以及核酶表达质粒的设计都会影响体外切割反应的切割效率。Goodchild和Kohli检测了不同碱基长度的旁侧序列对核酶动力学的影响，结果观察到：降低RZ与底物切点序列前后互补配对的碱基数目是提高Kcat值，增强核酶活性的可行途径。本实验设计的两个核酶各包括一个22核苷酸的催化核心和两边分别为7及8核苷酸的碱基序列，RZ与底物在切点前后共有15个互补配对碱基，其结构特异性高达4－15，保证了人造核酶能特异性识别底物而不破坏任何非靶RNA。
根据Perreault提出的模型，本试验对核酶与底物的体外切割反应结果进行了计算机分析。经计算得：＾179Er’＝5.0Kcal／mol，＾179Es’＝8.7Kcal／mol，＾179E＝－20.6Kcal／mol；＾196Er’＝4.8Kcal／mol，＾196Es’＝1.2Kcal／mol，＾196E＝－23.1Kcal／mol。从计算结果看：＾179Er’＞＾196Er’，＾179Es’＞＾196Es’，196RZ的切割活性高于179RZ。在实际的实验过程中，转录产生的核酶两侧会带有一段无关序列，这些序列与核酶的碱基配对区或催化核心区配对会使＾Er’增加，导致核酶切割活性降低，因此在设计过程中还应考虑转录产生的RZ旁侧无关序列对切割反应可能产生的影响。
三、影响核酶切割活性的因素
影响核酶切割活性的可能因素有：①切割位点；②转录产物的纯化，虽然转录产物的损失量减少，但不能排除其中的酶等蛋白物质对切割反应的影响；③反应的最适温度。＾E与反应的最适温度有关。无论是从核酶设计时的能量计算值，还是从切割反应的实验结果，都可观察到196MDR1 RZ的生物活性高于179MDR1 RZ，原因可能是196密码子在三维结构上比179位点更暴露于mRNA分子表面，所以196MDR1 RZ比较容易接近靶序列。此外，核酶的二级结构可影响其催化效率，179MDR1 RZ中有5’-GGACU-3’和5’-AGUCC-3’序列，二者形成的二级结构使179MDR1 RZ不能准确地与靶RNA形成碱基对，当然也不能很好地发挥RNA核酸内切酶的活性。
从实验结果看，核酶与底物的比率影响RZ的切割，比率越高，效率也越高。因为核酶在切割反应过程的同时具备生物酶的作用，在其达到饱和量之前，酶浓度越高，反应的速度也越快，反应产物也越多。反应中最适Mg2＋浓度为10mM或更高，已知人细胞内［Mg2＋］大约为0.5mM，所以实验中所用［Mg2＋］不超过10mM。除了Mg2＋外，其它二价阳离子，如Zn2＋、Mn2＋等，是否也会影响反应，将在以后的实验中进行探讨。■
参考文献：
［1］Mariko Itsubo MD,Tomohisa Ishikawa MD,Gotaro Toda MD,et al. Immunohistochemical study of expression and cellular Localization of the multidrug resistance gene product P-glycoprotein in primary liver carcinoma. Cancer,1994,73:298-303.
［2］Croop JM,Philippe Gros,David E. Housman Genetics of multidrug resistance. J Clin Invest,1998,81:1303-390.
［3］Jim Haseloff， Wayne L， Gerlach. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activities. Nature,1988,334:585-591.
［4］Kioka N，Jun Tsubota, Yoshiyuki Kakehi,et al. P-glycoprotein gene (MDR1) cDNA from human adrenal:nomal P-glycoprotein carries Gly185 with an altered pattern of multidrug resistance. Biochem. Biophys Res Commun,1989,162:224-231.
［5］刘顺英，魏志霞.体外培养人肝癌细胞对阿霉素耐药机理及电镜形态研究.中国肿瘤临床与康复，1998；5：1-4.
收稿日期：1999-07-11
修稿日期：1999-10-07
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