延迟整流性K+通道在肿瘤坏死因子α抑制人肝癌细胞增殖中的作用
中华实验外科杂志 1999年第5期第16卷 论著
作者：傅卫 周孝思 周培爱 吴才宏
单位：傅卫 周孝思 (100083 北京医科大学第三临床医学院普外科)；周培爱 吴才宏 (北京大学生物膜与膜生物工程国家重点实验室)
关键词： 延迟整流性K+通道；全细胞记录；肿瘤坏死因子α；人肝癌细胞系BEL-7402
【摘要】 目的 研究延迟整流性K+通道在肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制人肝癌细胞增殖中的作用。方法 采用膜片钳技术的全细胞记录方式记录人肝癌细胞的跨膜电流，氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入技术测定人肝癌细胞的DNA合成能力。结果 TNFα抑制肝癌细胞增殖的同时，未能使肝癌细胞膜离子通道的跨膜K+电流和细胞膜电导降低。K+通道阻断剂四乙胺不能进一步增加TNF抑制DNA合成的作用，且无明显量效关系和时间依赖性。结论 TNFα抑制人肝癌细胞增殖不是通过对细胞膜K+通道的干扰来实现。
The role of delayed rectifier K+ channel in the TNFα inhibition of the human hepatoctye carcinoma cells
FU Wei,ZHOU Xiaosi,ZHOU Peiai,et al.
(Department of General Surgery,The Third Teaching Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100083)
【Abstract】Objective To study the role of the delayed rectifier K+ channel in the TNFα inhibition of the human hepatocyte carcinoma cells.Methods The whole-cell recording technique of patch clamp was used to record the transmembrane current in the human hepatocyte carcinoma cells. 3H-TdR incorporation technique was used to measure the ability of DNA synthesis of the human hepatocyte carcinoma cells.Results TNF inhibited the cell proliferation of the human hepatocyte carcinoma cells. At the same time, TNF didn't decrease the K+ channel current and the conductance of hepatocyte carcinoma cell. TEA couldn't significantly enhance DNA inhibition induced by TNFα, without an obvious dose-effect relationship and time-dependence.Conclusion The inhibiting effect of a-TNF on the human hepatocyte carcinoma cells wasn't a result of depression on the K+ channel.
【Key words】 Delayed rectifier K+ channel Whole-cell recording TNFα Human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402
在人肝癌细胞上存在类似神经、肌肉细胞的延迟整流性K+通道［1，且人肝癌细胞的增殖活动需要延迟整流性K+通道参与［1］。在此基础上，我们进一步研究延迟整流性K+通道在肿瘤坏死因子TNFα抑制人肝癌细胞增殖中的作用。
材料与方法
1. 仪器与试剂 电极拉制器、微操纵器(Narishige)，EPC-7膜片钳放大器(List, Darmstadt Co.)，5.5.1版PClamp电信号采集程序、数据采集系统(Axon Instrument, Inc.)。盐酸四乙胺(TEA-Cl)，Mg-ATP，KF均为SIGMA产品。PRMI1640培养基(GIBCO)，TNFα(中国军事医学科学院帮定生物制品公司)，氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR，上海原子能研究所)。
2. 细胞外液、电极液的配制及玻璃微电极的制备同参考文献［1］。
3. 人肝癌细胞系BEL-7402细胞的准备 当细胞(北京医科大学药学及化学分析中心)在培养瓶中长成单层后，转入35mm×10mm的培养皿或培养板中继续培养48小时，然后按试验要求在各个培养皿中分别加入一定量的TNF、TEA或者兼有二者的RPMI1640培养液继续培养24小时。最后以膜片钳的全细胞方式记录细胞在钳制电压(HP)=-100mV，测试电压(TP)=-100～90mV条件下，不同TP、不同浓度TNF作用下的跨膜电流ITP，及相邻两TP(电压差10mV)间的细胞膜电导。同时进行细胞计数、测定3H-TdR掺入的cpm值。
4. 全细胞膜片钳记录 倒置显微镜下，在微操纵器操纵下，进行全细胞膜片钳的记录。膜片钳记录均在室温下进行。
结 果
1. 不同浓度的TNF对人肝癌细胞系BEL-7402细胞跨膜电流ITP及相邻两测试电压间细胞膜电导的影响见表1、2。
表1 不同浓度的TNF对人肝癌细胞系BEL-7402细胞跨膜电流IIP的影响(pA，
±s)
| TP |
TNF的浓度 |
| 0U/ml(n=14) |
50U/ml(n=6) |
100U/ml(n=6) |
| -100 |
-79.29±24.01 |
-66.67±29.44 |
-73.88±33.03 |
| -90 |
-53.34±28.01 |
-38.89±24.19 |
-50.28±28.78 |
| -80 |
-18.72±36.43 |
-9.72±16.51 |
-29.44±25.75 |
| -70 |
11.49±44.21 |
25.00±19.72 |
-5.83±32.98 |
| -60 |
47.77±50.05 |
64.44±29.30 |
21.94±32.84 |
| -50 |
82.86±53.18 |
106.90±40.97 |
41.39±41.97 |
| -40 |
126.80±58.26 |
151.90±61.93 |
67.78±56.73 |
| -30 |
168.20±72.29 |
197.20±78.51 |
94.17±66.45 |
| -20 |
213.00±84.34 |
248.60±97.33 |
131.70±72.04 |
| -10 |
259.60±100.00 |
304.20±116.60 |
167.80±89.11 |
| 0 |
313.30±123.20 |
369.40±136.30 |
215.00±105.33 |
| 10 |
374.10±146.90 |
429.20±152.50 |
264.70±113.70 |
| 20 |
435.40±175.10 |
498.60±163.60 |
321.90±139.30 |
| 30 |
507.70±191.10 |
572.20±182.60 |
393.10±155.00 |
| 40 |
601.70±222.90 |
644.70±195.60 |
473.60±185.50 |
| 50 |
693.80±238.30 |
731.70±204.50 |
579.90±200.90 |
| 60 |
819.60±269.40 |
822.80±218.50 |
712.20±227.90 |
| 70 |
938.30±299.60 |
923.10±234.70 |
868.90±241.90 |
| 80 |
1093±333.40 |
1023±252.20 |
1047.0±277.00 |
| 90 |
1232±380.1 |
1128±265.80 |
1272.0±322.40 |
注：TP=-100～90mV时，不同TP下的跨膜电流，50U/ml\,100U/ml与0U/ml相比较P值均大于0.05
表2 不同浓度的TNF对人肝癌细胞系BEL-7402细胞相邻两测试电压间的细胞膜电导的影响(±s,nS)
| 相邻两TP
(mV) |
TNF的浓度 |
| 0U/ml(n=14) |
50U/ml(n=6) |
100U/ml(n=6) |
| -90～-100 |
2.574±1.815 |
2.778±0.861 |
2.360±0.975 |
| -80～-90 |
3.482±1.185 |
2.917±1.021 |
2.083±1.728 |
| -70～-80 |
3.021±1.656 |
3.472±1.781 |
2.361±1.781 |
| -60～-70 |
3.628±1.604 |
4.444±1.948 |
2.778±1.361 |
| -50～-60 |
3.509±1.528 |
3.750±1.467 |
1.944±1.009* |
| -40～-50 |
4.393±1.205 |
4.500±2.211 |
2.639±2.069* |
| -30～-40 |
4.143±1.817 |
4.528±2.096 |
2.639±1.529 |
| -20～-30 |
4.476±1.847 |
5.139±1.930 |
3.750±0.697 |
| -10～-20 |
4.658±2.011 |
5.556±2.018 |
3.611±1.876 |
| 0～-10 |
5.372±2.416 |
6.528±2.001 |
4.722±1.949 |
| 10～0 |
6.086±2.656 |
5.972±1.931 |
5.138±1.617 |
| 20～10 |
6.131±3.387 |
6.944±1.361 |
5.556±2.871 |
| 30～20 |
7.229±2.579 |
7.361±2.322 |
7.111±2.165 |
| 40～30 |
9.396±5.265 |
7.250±1.882 |
8.055±3.860 |
| 50～40 |
9.211±3.494 |
8.694±1.904 |
10.63±3.079 |
| 60～50 |
12.57±5.070 |
9.111±2.178 |
13.23±4.603 |
| 70～60 |
11.88±6.746 |
10.03±3.150 |
15.67±2.148 |
| 80～70 |
15.47±6.346 |
9.972±4.639 |
17.86±5.854 |
| 90～80 |
13.85±6.806 |
10.50±2.616 |
22.49±8.745* |
注：与0U/ml相比较*P＜0.05
2. TNF对肝癌细胞计数的影响 细胞在含有0、50、100U/ml不同浓度TNF的培养液中分别培养24小时后，细胞计数分别为(32.370±5.468)×104个(n=4)、(23.010±4.708)×104个(n=4)、(21.500±1.780)×104个(n=4)，与0U/ml相比，P值均小于0.05，表明TNF使细胞数目明显减少，抑制了细胞的增殖。
3. TNF和TNF加TEA对肝癌细胞DNA合成的影响 (1)TNF对肝癌细胞DNA合成的影响见图1。(2)恒定浓度的TEA(10mmol/L)与不同浓度的TNF对DNA合成的影响见图1。(3)不同浓度的TEA与恒定浓度的TNF(50U/ml)对肝癌细胞DNA合成的影响：0、5、10、20mmol 4种不同浓度的TEA，其cpm值分别为(8.468±1.809)×103，n=6)、(8.450±1.682)×103，n=6)、(8.231±1.971)×103(n=6)、(8.219±1.605)×103(n=6)，与0mmol/L TEA相比，P值均大于0.05，cpm值未随培养基中TEA浓度的增高进一步减低。(4)在含有50U/ml TNF的培养基中培养的肝癌细胞接触TEA(10mmol/L)的时间对DNA合成的影响：3H-TdR掺入前23、18、12小时和即刻cpm值分别为(9.831±1.736)×103(n=6)、(8.422±1.436)×103(n=6)、(8.406±1.366)×103(n=6)、(8.152±1.251)×103(n=6)，与10mmol/L TEA培养0小时相比，P值均大于0.05。随着细胞接触10mmol/L TEA时间的延长，对DNA合成的抑制作用也未能被进一步加强。
图1 10mmol/L TEA对肝癌细胞在不同浓度的TNF中DNA合成的影响(n=6)注：*P＜0.05
讨 论
近年来细胞膜作为肿瘤化疗的靶器官越来越受到重视［2］。本试验旨在研究细胞膜上的延迟整流性K+通道在TNFα抑制人肝癌细胞增殖中的作用。在本实验中，TNF能明显使人肝癌细胞系BEL-7402细胞的数目和DNA合成降低，而且培养液中的TNF浓度愈高，这种作用也愈明显。表明TNF能抑制肝癌细胞系BEL-7402细胞的增殖。但是不同浓度的TNF未能使细胞的跨膜电流和细胞膜电导明显下降。以上结果表明TNF抑制细胞增殖的同时，未能改变人肝癌细胞系BEL-7402细胞延迟整流性K+通道的电压门控特性。
在加入不同浓度TNF的培养液中，恒定浓度(10mmol/L)的K+通道特异性阻断剂TEA未能加强TNF对DNA合成的抑制作用，与未加入TEA的对照组相比差异无显著性。这是本试验中TNF抑制肝癌细胞增殖的同时不需要K+通道开放的又一证据。
本实验结果显示，TEA的剂量与抑制DNA合成的幅度之间无明显的量效关系，TNF抑制DNA合成的作用不因肝癌细胞在含有50U/ml TNF的培养液中与10mmol/L TEA培养的接触时间的延长而进一步加强。这亦佐证TNF抑制肝癌细胞的增殖不需要K+通道开放这一结论。
综上所述，TNF抑制人肝癌细胞系BEL-7402细胞的增殖和DNA合成，不是通过对细胞膜K+通道的干扰来实现的。
参考文献
1 傅卫，张宗明，周培爱，等.人肝癌细胞膜离子通道特性研究.北京医科大学学报，1998，30：115-117.
2 Hans. Grunicke. The cell membrance as a target for cancer chemotherapy. Eur J Cancer, 1991, 27:281-284.
(收稿：1998-07-09 修回：1998-09-20)
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