细胞稳定钙离子内流抑制剂羧基胺基咪唑抑制人肝癌诱导的血管形成

中华实验外科杂志 1999年第6期第16卷 肝癌外科

作者：李晓明　孙惠川　汤钊猷　周俭

单位：200032　上海医科大学中山医院肝癌研究所

　　关键词： 钙离子内流抑制剂，羧基胺基咪唑；内皮细胞；血管形成，病理性；肿瘤，人肝癌

　　【摘要】　目的　观察细胞稳定钙离子内流抑制剂羧基胺基咪唑(CAI)抑制内皮细胞构建新生血管和人肝癌诱导血管形成的作用。方法　应用MTT、Boyden培养皿和人工基质，研究CAI对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移、降解基质和构建血管能力的影响，利用LCID-20瘤株裸鼠角膜模型观察CAI对人肝癌诱导血管形成能力的影响。结果　CAI的浓度超过10mmol/L时，内皮细胞的增殖明显抑制；与对照组相比，CAI组细胞的迁移、降解基质和构建血管的能力下降(P＜0.05)；2μl CAI(100μmol/L)软膏动物涂眼，每日2次，CAI组动物角膜新生血管的数目和长度分别小于和短于对照组(P＜0.05)。结论　CAI能够明显抑制内皮细胞构建新生血管和人肝癌诱导的血管形成。

Cytostatic calcium influx inhibitor carboxyamido-triazole inhibited angiogenesis induced by human hepatocellular carcinoma

LI Xiaoming, SUN Huichuan, TANG Zhaoyou.

　　Liver Cancer Institute, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

　　【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effects of carboxyamido-triazole (CAI) on angiogenesis induced by human hepatocellular carcinoma (HCC).Methods MTT, boyden chamber and matrigel were used as models to study the effect of CAI on proliferation, motility and tube formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Tumor spheroids from the metastatic tumor line of HCC were implanted into the corneal micropockets of nude mice, and 2 μl CAI (100 μmol/L) was given as lotion on the nude mice eyes twice every day.Results CAI suppressed proliferation of HUVECs, reduced motility through the matrigel and inhibited tube formation (P＜0.05). Compared with control group, the neovascularization induced by HCC on corneal was markedly inhibited in CAI-treated group (P＜0.05).Conclusion CAI could inhibit neovascularization formed by HUVECs and angiogenesis induced by HCC.

　　【Key words】 Calcium influx inhibitor Carboxyamido-triazole HUVECs Angiogenesis Human hepatocellular carcinoma

　　羧基胺基咪唑(CAI)是一种钙离子非电位通道抑制剂，具有抑制血管生长因子诱导的血管形成，延缓肿瘤病程，稳定病情的药理作用。我们利用裸鼠角膜血管形成模型等手段，探讨了CAI对人肝癌细胞诱导血管形成的抑制作用。

　　 材料和方法

　　1. 细胞培养和人肝癌高转移瘤株　CAI由美国国立癌症研究院Kohn E.C博士惠赠，溶于二甲亚砜制成母液(10mmol/L)。内皮细胞取自胎儿脐静脉，体外M199培养液加体积分数为10%胎牛血清(美国GIBCO公司)和血管内皮细胞生长因子(VEGF，1nmol/L，英国PeproTech公司)培养，传代4～9次后用于实验。肿瘤组织取自本所建立的人肝癌高转移瘤株LCI D-20^［1］。

　　2. MTT实验　将内皮细胞接种96孔板，每孔1×10⁴个细胞，设对照、二甲亚砜(DMSO)、CAI共3组，用梯度稀释的CAI与内皮细胞共孵育24小时后，常规操作，酶标仪检测OD值。

　　3. 内皮细胞运动和酶解分析　将人工基质Matrigel(北京医科大学病理教研室)稀释于无血清M199培养液中300mg/L，50μl加入Boyden培养皿(美国Costor公司)的上室，上室的底部封有8μm微孔滤膜，室温放置1小时，下室加入3T3无血清培养液，内皮细胞与10μmol/L的CAI孵育24小时后，重悬于含0.1%牛白蛋白和血管内皮细胞生长因子(1nmol/L)的无血清M199培养液中，1×10³个细胞加入Boyden上室，37℃培养12小时后，擦净上室内培养液，小室底膜HE染色，选择5个高倍镜视野细胞计数。

　　4. 内皮细胞血管构建　内皮细胞重悬于0.1%牛白蛋白、血管内皮细胞生长因子和50mg/L Marigel的无血清M199培养液中，按1×10⁴个孔接种24孔板，CAI为10μmol/L，37℃培养24小时。

　　5. 角膜血管形成模型　在手术显微镜下将LCI D-20肿瘤组织切成0.3mm³的小块，然后接种于BALB/c-nu/nu裸鼠角膜上的微囊，将CAI与红霉素软膏混合，终浓度为100μmol/L。2μl涂眼，每日2次，微循环检测仪观察。将裸鼠角膜圆周分成钟表样12等份，以“小时”为单位计算角膜血管形成扇区的大小，将角膜缘到中心的距离分成5份，计算新生血管的长度，以及新生血管的条数。

　　6. 统计学方法　采用方差分析和t检验。

　　结果

　　1. CAI对内皮细胞生长的抑制作用　图1所示，当CAI的浓度在0.625～5μmol/L时，内皮细胞的生长没有受到影响，但是当超过10μmol/L时，内皮细胞的生长速度明显受到抑制，细胞由多角形和梭形变成长条形，没有发现死亡细胞。DMSO组和空白对照组细胞的生长没有受到影响。

图1　CAI对人脐静脉内皮细胞生长的抑制作用

　　2. CAI对内皮细胞运动和降解基质的抑制　CAI处理组内皮细胞作变形运动，降解人工基质，穿过微孔滤膜的数目(3.8±2.3)明显少于对照组(13.8±4.4)，两组差异有显著性(P＜0.05)。穿过微孔滤膜的内皮细胞，CAI组明显少于对照组，且形态也有所改变。

　　3. CAI对内皮细胞构建血管的抑制　CAI抑制了内皮细胞在含有血管内皮细胞生长因子和人工基质的无血清培养基中构建血管的能力，CAI组形成的血管样结构较为稀疏和松散，而对照组血管样结构较为致密和整齐。

　　4. CAI抑制人肝癌诱导的血管形成　荷人肝癌LCI D-20裸鼠角膜应用CAI软膏涂眼4天后，肿瘤诱导的血管形成开始少于对照组，用药第7天时，治疗组动物角膜新生血管的数目［(5.7±2.1)条］明显少于对照组［(12.3±2.5)条］且所形成的新生血管长度(2.7±1.5)亦较对照组(5.3±0.6)短。

　　讨论

　　本研究结果显示，当CAI的浓度超过10μmol/L时，VEGF诱导内皮细胞的增殖受到抑制，具有明显的剂量依赖性，细胞由多角形或梭形变成细长形，而且，这种抑制是非细胞毒作用，没有发现死亡细胞。在Boyden上室中的内皮细胞，由于受到下室中3T3细胞上清的趋化，必须降解和穿过在滤膜上方的人工基质，并且作变形运动穿过直径8μm的微孔，才能到达滤膜的背面，10μmol/L的CAI明显抑制了内皮细胞降解并穿过基质和微孔的能力，从而抑制了血管形成的关键环节。在含有Matrigel的无血清培养基中，VEGF能够诱导 内皮细胞排列成血管样结构，形成纵横交错的网，当加入CAI(10μmol/L)后，形成的血管网明显稀疏，排列亦较为整齐。VEGF诱导的血管形成的几个关键环节均受到了CAI不同程度的抑制。

　　本研究结果表明，CAI能够通过改变血管内皮细胞侵袭性生物学特征，抑制人肝癌诱导的血管形成，抗肿瘤血管形成将成为预防肝癌复发和转移的新途径。

　　参考文献

　　1　Sun F, Tang Z, Liu K, et al. Establishment of a metastatic model of human hepatocellular carcinoma in nude mice via orthotopic implantation of histologically intact tissues. Int J Cancer, 1996, 66:239-241.

(收稿：1999-04-10)