结合半乳糖基抗CD3单抗的肿瘤浸润淋巴细胞对自体肝癌细胞杀伤的形态学研究
中华实验外科杂志 2000年第2期第17卷 实验研究
作者：蒋平 何生 章崇杰 赵宗蓉 庞其捷 宋志平
单位：蒋平(现在温州医学院第二附属医院肝胆外科，325027)；何生(610041 成都，华西医科大学附属第一医院肝胆外科)；章崇杰 赵宗蓉(基础医学院免疫教研室)；庞其捷 宋志平(华西医科大学制药厂研究所)
关键词： 肿瘤浸润淋巴细胞；抗CD3单克隆抗体；凋亡；坏死；形态学观察
【摘要】 目的 获取与半乳糖基抗CD3单抗结合的肿瘤浸润淋巴细胞(McAb-TIL)杀伤自体肝癌细胞的形态学证据，并进行杀伤机制探讨。方法 制备McAb-TIL，将其与H22小鼠肝癌细胞共同孵育，于不同时间在倒置显微镜和透射电镜下观察。结果 McAb-TIL呈增殖活化状态，与靶细胞共同孵育0.5 h即可导致靶细胞严重损伤。杀伤靶细胞后的McAb-TIL结构清晰、完整。凋亡与坏死形态学改变可共存于同一个被杀伤靶细胞。结论 偶联了大量半乳糖基的抗CD3单抗仍具有很强的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)活化作用。McAb-TIL通过多种杀伤机制杀伤自体肝癌细胞，杀伤力极强，具有连续杀伤靶细胞的能力。
Morphologieal observation on cytolytic activity against autologous liver cancer cells of tumor infiltrating lymphocytes integrating with galactosyle-anti CD3 monoclonal antibody
JIANG Ping, HE Sheng, ZHANG Chongjie, et al.
(Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)
【Abstract】 Objective To pursue the morphological evidence and study the mechanism of cytolytic activity against autologus liver cancer cells of tumor infiltrating lymphocytes integrating with galactosyl-anti CD3 monoclonal antibody(McAb-TIL).Methods McAb-TILs were prepared and then were incubated together with H22 liver cancer cells of the mice in vitro, and the cytolytic activity of McAb-TIL was observed under the inverted phase contrast microscope and transmission electron microscope at different time points.Results The McAb-TILs presented a fully activated state. Only after 0.5 h of incubation, target cells were damaged seriously, and morphologically, the co-existence of apoptosis and necrosis in the same killed target cells could be observed. The McAb-TILs kept still intact in structure after killing target cells.Conclusions TILs can be activated by anti-CD3 monoclonal antibody coupled with a great deal of galactose. McAb-TILs have strong cytolytic activity against autologous liver cancer cells by mutiple mechanisms, and can resume to kill other target cells.
【Key words】 Tumor infilitrating lymphocyte;Anti-CD3 monoclonal antibody;apoptosis;Necrosis;Morphology 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)对自体肿瘤细胞有特异性杀伤作用，如能使其在肝靶器官浓聚，可能有助于减少肝癌切除术后肝内转移与复发。为此，我们制备了与半乳糖基抗CD3单抗结合的肿瘤浸润淋巴细胞(McAb-TIL)，并证明它在体外具有良好的趋肝细胞性［1］。本研究旨在获得McAb-TIL杀伤自体肝癌细胞的形态学佐证，探讨其杀伤的可能机制，为该课题的深入研究提供可靠的实验依据。材料与方法
1.McAb-TIL制备：见参考文献［1］的方法。
2.靶细胞：取H22小鼠肝癌细胞株(华西医科大学肿瘤研究所)，置于37℃、体积分数为5%CO2条件下孵育备用。
3.光镜标本制备：取H22小鼠肝癌细胞株用RPMI1640培养液调至1.0×107个/L，取4 ml加入曲颈细胞培养瓶。另取McAb-TIL调至2.0×108个/L，取4 ml加入上述培养瓶，置37℃、体积分数为5%CO2条件下孵育，于0.5、1、3、6 h在倒置显微镜下观察。
4.透射电镜标本制备：同法将H22小鼠肝癌细胞株调至1.0×108个/L，分别加入4个塑料离心管中，每管0.5 ml。另取McAb-TIL调至2.0×108个/L，分别以0.5 ml加入上述4个离心管，置37℃、体积分数为5%CO2条件下孵育。于0.5、1、3、6 h终止孵育，制作成500～600超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色后透射电子显微镜(Hitachi公司，H-600IV型)下观察。
结 果
1.倒置显微镜下观察：McAb-TIL呈不规则形的增殖活跃状态。共同孵育0.5 h，多个McAb-TIL伸出突起与靶细胞粘附；1 h，靶细胞结构模糊，较多靶细胞碎片漂浮于培养液中；3 h及6 h，已难见形态结构较完整靶细胞，大量细胞碎片漂浮于培养液中，所见McAb-TIL形态良好。
2.透射电镜下观察：McAb-TIL细胞体积增大，胞浆增多，胞浆内线粒体、内质网及高电子密度颗粒丰富，常染色体丰富、疏松。共同孵育0.5 h，McAb-TIL伸出伪足与靶细胞膜接触，接触处及其他多处的靶细胞膜破裂、中断，靶细胞核膜消失，核变性凝聚，内质网扩张，线粒体肿胀，线粒体嵴隐约可见(图1)，部分靶细胞核染色质聚集成致密大小不等的团块状物，贴附于核膜内缘，即染色质边缘化，内质网扩张，细胞膜破坏消失(图2)；1 h，McAb-TIL伪足伸入破碎靶细胞浆内，靶细胞膜完全消失，细胞内结构向四周扩散(图3)；3 h及6 h，靶细胞极度破坏，细胞器结构不清，细胞核消失，呈大空腔状(图4)。在整个观察过程中，McAb-TIL结构清晰、完整。
图1 共同孵育0.5h,McAB-TIL伸出伪足与靶细胞膜接触,靶细胞膜多处中断,核膜消失,核变性凝聚,内质网扩张,线粒肿胀(×5000)
图2 共同孵育0.5h,靶国胞核试验内染色质边缘人,内质网扩张,靶细胞膜破坏(×6000)
图3 共同孵育1.0h,McAB-TIL伪足伸入破碎靶细胞浆内，靶细胞膜完全消失，细胞内结构扩散(×6000)
图4 共同孵育6h,靶细胞核消失,呈大空腔状,靶细胞极度破坏。McAB-TIL结构完整、清晰(×4000)
讨 论
抗CD3单抗可以替代T细胞的第一信号，与CD3分子结合后通过跨膜信息启动与传递，激活核内DNA复制，促进细胞增殖分裂与功能激活。我们将半乳糖基抗CD3单抗与TIL共同培养24 h，在光镜、电镜下均观察到McAb-TIL处于相当激活状态，这说明偶联了大量半乳糖的抗CD3单抗仍然具有很强的活化TIL作用。
TIL的杀伤功能主要依赖于其中的细胞毒性T细胞(CTL)，当活化的CTL与靶细胞接触时，穿孔素、粒酶等被释放至两细胞结合处，穿孔素插入靶细胞膜中形成孔道，大量离子和水分通过孔道进入靶细胞导致细胞溶解坏死［2］。一些效应分子，如粒酶肿瘤坏死因子(TNF)等也从孔道进入靶细胞导致细胞死亡，称为穿孔素的间接杀伤作用。CTL还可通过激活表达Fas配体［3］，并释放到胞外与靶细胞表面的Fas抗原结合，传导死亡信号入胞内，引起细胞凋亡。本实验结果显示，McAb-TIL与靶细胞共同孵育0.5 h，即发现二者粘附，电镜下靶细胞结构损伤已相当严重。1、3、6 h，靶细胞的细胞器高度变性且四处扩散，细胞核及细胞膜均消失，光镜下也见大量细胞碎片。这些观察说明McAb-TIL有极强的杀伤自体肝癌细胞能力，杀伤靶细胞所需时间短暂。分析其原因，除McAb-TIL具有上述2种杀伤靶细胞途径外，还与抗CD3单抗促使T细胞表达白细胞介素(IL)-2受体量增加，产生释放多种细胞因子如IL-2、IL-4、肿瘤坏死因子、γ-干扰素、集落刺激因子等有关。
本实验结果还显示，部分被杀伤的靶细胞既具有染色质边缘化、内质网扩张等凋亡形态学改变，又具有细胞膜破坏、消失等坏死形态学改变，表明靶细胞并非仅按1种典型的凋亡或坏死方式来被杀伤，而是通过多种机制被杀伤，所以出现凋亡与坏死共存同一个被杀伤靶细胞的形态学改变。
本实验中尚见未与McAb-TIL接触的靶细胞也被杀伤，这可能是抗CD3单抗促使TIL分泌多种细胞因子作用的结果。另外，由于TIL杀伤靶细胞后可从靶细胞上脱落再循坏利用［4］，我们观察到的也可能是McAb-TIL脱落后的被杀伤靶细胞。在整个观察过程中，发现McAb-TIL杀伤靶细胞后自身结构清晰、完整，仍处于激活状态，完全具备再次攻击其他靶细胞的能力。
(本文图1～4见封二)
基金项目：四川省科委应用基础研究基金资助项目
参考文献
1 蒋平，何生，章崇杰，等.半乳糖基抗CD3单抗-TIL体外趋肝性研究.华西医科大学学报，1999，30：72-74.
2 Liu CC,Walsh CM,Young JD.Perforin:structure and function.Immunol Today,1995,16:194-201.
3 Anel A,Simon AK, Auphan N, et al.Two signaling pathways can lead to Fas ligand expression in CD8+cytotoxic T lymphocyte clones. Eur J Immunol, 1995,25:3381-3387.
4 Isaaz S,Baetz K, Olsen K, et al. Serial killing by cytotoxic T lymphocytes:T cell receptor triggers degranulation,re-filling of the lytic granules and secretion of lytic proteins via a non-granule pathway. Eur J Immunol, 1995,25:1071-1079.
(收稿日期：1999-11-12)
用户登录 
新用户注册