bcl－2阳性胃癌细胞系BGC－823凋亡模型的建立^＊

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第8期

路平　陈峻青　王舒宝

　　摘　要　目的：研究bcl－2阳性胃癌细胞系BGC－823凋亡模型的建立。方法：应用相差显微镜、电子显微镜、流式细胞术和DNA电泳观察BGC－823胃癌细胞系凋亡的发生。结果：30μmol/Lbcl－2反义寡核苷酸、2μg/ml顺铂、20μg/ml卡铂、4μg/ml阿霉素、4μg/ml丝裂霉素处理胃癌细胞，24小时后观察到肿瘤细胞缩小、凋亡小体出现、染色质浓缩、凋亡峰及DNA梯状条带等凋亡特征性改变。结论：反义寡核苷酸调控bcl－2基因表达的意义，不仅仅在于增强或减弱药物等凋亡之诱导因素的作用，而作为独立的以凋亡为靶向治疗肿瘤的方法开辟了新途径。

　　 　　关键词：凋亡　bcl－2　反义寡核苷酸　胃肿瘤

　　最新研究认为细胞凋亡的异常是肿瘤发生发展的重要因素^[1]。近年来，有关凋亡的文献报道甚多，但有关bcl－2阳性胃癌细胞系凋亡的研究甚少。本研究选用两条bcl－2反义寡核苷酸和临床常用的化疗药物顺铂诱导胃癌BGC－823细胞凋亡，旨在建立胃癌凋亡模型，为研究胃癌凋亡的分子机制奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂

　　小鼠抗人bcl－2单抗（SantaCruz），FITC标记的羊抗鼠IgG（ZYMED），生物素标记的羊抗鼠IgG(ZYMED),SP试剂盒（ZYMED），碘化丙啶（PI，Sigma），总RNA分离试剂盒（GibcoBRL），反转录试剂盒（MBI），TaqDNA聚合酶（Promega）。bcl－2反义寡核苷酸序列^[2]：5′－CAGCGTGCGCCATATTTCCC－3′（mRNA的翻译起始区），bcl－2cDNA序列：3′－GTCGCACGCGGTATAAAGGG－5′（上海细胞研究所合成）。

　　1.2　细胞培养

　　人急性早幼粒白血病细胞系HL－60、结肠癌细胞系SW－1116（沈阳军区陆军总医院临床实验室惠赠）和人结肠癌细胞系Y－99，人胃癌细胞系BGC－823、人胃癌细胞系MGC－803（由北京肿瘤研究所惠赠）、均在含10％新生牛血清的RPMI－1640培养液和37℃、95％湿度及5％CO₂的条件下连续培养。

　　BGC－823细胞系培养至指数增殖期，处理组加入30μmol/Lbcl－2反义寡核苷酸或对照寡核苷酸、2μg/ml顺铂、20μg/ml卡铂、4μg/ml阿霉素、4μg/ml丝裂霉素，正常培养细胞为对照组，相差显微镜观察细胞形态学改变，根据检测项目以不同的时间消化细胞收集标本待测。

　　1.3　bcl－2免疫组织化学染色方法

　　标本制作：指数生长期细胞移至铺灭菌盖玻片的六孔培养板，浓度为2×10⁴个/ml，24小时后取出玻片（HL60细胞，离心后将细胞悬液滴于赖氨酸处理的玻片上），固定，－20℃保存待测。染色方法：3％过氧化氢5分钟，10％羊血清10分钟，bcl－2单抗（1:50），37℃45分钟，二抗(1:300)，37℃30分钟，辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP，1:300),37℃30分钟，DAB5分钟。

　　1.4　RT－PCR检测bcl－2mRNA表达

　　逆转录反应：70℃5分钟，37℃60分钟，70℃10分钟至4℃保存。PCR反应：94℃4分钟，PCR反应参数为92℃40秒，60℃40秒，70℃45秒，进行30次循环后，75℃延伸5分钟。

　　1.5　流式细胞术检测细胞周期及凋亡峰变化^[3]70％冷乙醇4℃固定24小时以上，RNA酶A37℃30～60分钟，PI4℃避光20～30分钟待测。

　　1.6　电镜标本的制作

　　按常规扫描和透射电镜标本的制备进行。

　　2　结果

　　2.1　bcl－2阳性细胞系的确立

　　免疫组织化学方法检测bcl－2蛋白在肿瘤细胞系的表达：HL－60为阳性对照标本，BGC－823、MGC－803、Y－99均为bcl－2蛋白表达阳性细胞系，胞浆可见大量黄色DAB着色颗粒（图1）。SW－1116为bcl－2蛋白表达阴性细胞系。

图1　胃癌BGC－823细胞系bcl－2阳性表达

　　RT－PCR检测肿瘤细胞系bcl－2mRNA表达水平：RT－PCR产物经2％琼脂糖电泳显示（图2），人急性早幼粒白血病细胞系HL－60、人胃癌细胞系BGC－823、人胃癌细胞系MGC－803、人结肠癌细胞系Y－99均在635bp处出现特异性的bcl－2基因条带，结肠癌细胞系SW－1116在635bp处未出现特异性的bcl－2基因条带。

图2　PT－PCR电泳结果

M为分子量标志，1为HL－60，2为BGC－823，3为MGC－803，

　　4为Y－99，5为SW－1116，1～4为bcl－2阳性，5为阴性

　　2.2　胃癌细胞凋亡的检测

　　2.2.1　形态学改变相差显微镜观察：正常培养的BGC－823细胞系呈多角型贴壁伸展生长于培养瓶中。药物处理24小时后均出现细胞体积缩小、细胞皱缩、细胞解离成彼此粘附成簇的圆型小体－凋亡小体（图3）。扫描电镜形态变化：正常培养的BGC－823细胞表面可见均匀一致的绒毛伸展贴附于玻片上，细胞形态为多角型。处理后见细胞体积缩小，癌细胞表面微绒毛减少，凋亡小体出现（图4）。透射电镜改变：可见癌细胞核染色质聚积于核周，细胞核固缩，电子密度增高（图5）。

图3　反义寡核苷酸（OND）处理后BGC－823细胞体积缩小，凋亡小体出现

图4　OND处理后扫描电镜下凋亡小体×3000

图5　OND处理后透射电镜下染色质聚积×5000　30μmol/LOND处理后G₁峰出现，正常培养的BGC－823细胞DNA直方图

　　2.2.2　流式细胞仪检测DNA含量变化处理24小时后，在DNA组方图上（图6）可见细胞凋亡峰（亚G₁峰）出现，S期、G₂M期细胞百分率下降。

图6　处理24小时后DNA组方图

　　2.2.3　DNA电泳结果胃癌细胞可见DNA梯状带，正常培养细胞和对照组为一条完整的基因组DNA条带（图7）。

图7　DNA电泳1～4为OND、顺铂、对照OND和正常培养细胞

　　3　讨论

　　凋亡已成为生命科学研究的热点，且人们已经认识到：凋亡于肿瘤的发生发展及治疗的过程中起着非常重要的作用，以诱发凋亡为新的靶点，为肿瘤的治疗提供了新思路。目前的研究认为抗肿瘤化疗药物，放射治疗，温热治疗均以不同程度的诱导凋亡途径发挥抗肿瘤效果^[4]。癌症具有不同的生物学行为，胃癌的生物学行为尤为殊著。本实验应用免疫组化和RT－PCR方法，从蛋白和基因水平检测到人胃癌细胞系MGC－803、BGC－823为bcl－2基因阳性表达。且观察到：人工合成的bcl－2反义寡核苷酸、顺铂、卡铂、阿霉素、丝裂霉素，均有良好的诱导BGC－823，胃癌细胞系细胞凋亡的作用，为胃癌凋亡的分子机制研究提供了有价值的实验基础。

　　凋亡是多基因调控的生理过程，其调控基因中bcl－2为凋亡的主要拮抗基因。近年来研究发现：bcl－2基因高表达抑制化疗药等凋亡诱导因素的作用^[5]，多种因素诱导细胞凋亡的过程中bcl－2基因mRNA表达水平下降^[6]。Reed^[7]、Ziegler^[2]等在白血病细胞系和肺癌细胞系证实bcl－2反义寡核苷酸可抑制肿瘤细胞的增殖。然而，反义寡核苷酸阻断肿瘤细胞bcl－2基因的高表达，对凋亡程序的影响尚未见进一步研究，我们首次观察到bcl－2反义寡核苷酸24小时内即可诱发胃癌细胞系凋亡，并应用相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪、DNA电泳多项方法得到证实。因此，我们认为：反义寡核苷酸调控bcl－2基因表达的意义，不仅仅在于增强或减弱药物等凋亡诱导因素的作用，bcl－2反义寡核苷酸作为独立的以凋亡为靶向的治疗方法，为肿瘤的治疗开辟了新的途径。

　　＊本文课题受卫生部直属机构重点项目基金及辽宁省自然科学基金资助编号（962308）

　　作者单位：中国医科大学第一临床学院肿瘤科（沈阳市　110001）

参考文献

　　1　Milas L,Stephens C,Meyn RE. Relation of apoptosis to cancer therapy. In Vivo,1994;8:665

　　2　Ziegler A,Luedke GH, Fabbro D,et al. Induction of apoptosis in small－ cell lung cancer cells by an antisense oligodeoxynucleotide targeting the bcl－ 2 coding sequence. J Natl Cancer Inst,1997;89:1027

　　3　Darzynkiewicz Z,Bruno S,Del Bino G,et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry,1992;13:795

　　4　Hale AJ,Smith CA,Sutherland LC,et al.Apoptosis:molecular regulation of cell death.Eur J Biochem,1996;236:1

　　5　Schwarze MMK, Hawley RG. Previntion of myeloma cell apoptosis by ectopic bcl－ 2 expression or interleukin 6－ mediated up－ regulation of bcl－ XI. Cancer Res,1995;55:2262

　　6　Chen M, Quintans J, Fuks Z,et al. Suppression of bcl－ 2 messenger RNA production may mediate apoptosis after ionizing radiation,tumor necrosis factor α ,and ceramide.Cancer Res,1995;55:991

　　7　Reed JC,Stein C, Subasinghe C,et al. Antisense mediated inhibition of bcl－ 2 protooncogene expression and leukemic cell growth and survival: comparisons of phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotides.Cancer Res,1990;50:6565