胃癌中p16基因研究概况

　　中国普外基础与临床杂志1999年第6卷第3期

刘君综述　蒲永东 宋少柏审校

　　关键词：p16基因 癌基因 抑癌基因 胃癌

　　分子生物学和基因工程技术的迅速发展使我们认识到，胃癌的发生同其他肿瘤一样是正常细胞内基因组多重改变的结果。自发的、化学物理性及病毒性致癌因素只是诱因，基因改变才是根本原因，它包括癌基因的激活和抑癌基因的失活^〔1〕。p16(MTS1、CDKN2、CDK₄I)基因是新近发现的抑癌基因，与p53基因相比，它具有突变率高、分子量小、易于标定等特点，因而很快成为肿瘤分子生物学研究的热点。本文就胃癌中p16基因的研究情况作一概述。

　　1　p16基因的分子生物学特点

　　1993年，Serrano等^〔2〕在研究与细胞周期素依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK₄)相作用的蛋白时，用酵母双杂合蛋白相关性筛选(yeast two-hygrid protein interaction screen)法分离到了特异性CDK₄抑制蛋白p16蛋白，并成功地克隆了其cDNA。1994年Kamb等^〔3〕用STS-PCR(serveral-tagged sites-PCR，多标志位点PCR)方法研究了100个黑色素瘤细胞系，发现了在人第9号染色体短臂(9p21)区域存在有与Serrano等报道的p16序列相近的2个区域，分别命名为多发性肿瘤抑制因子1(multiple tumor suppressor 1, MTS 1)和多发性肿瘤抑制因子2(MTS 2)，其中MTS 1与曾报道的p16基因完全吻合，而MTS2与p16基因有93%的序列同源，目前已命名为p15基因。与此同时，Nobori等^〔4〕的研究也证实了上述结论。Serrano等^〔2〕指出，p16基因定位于人第9号染色体的9p21区位，分布在全长为8.5 kb的DNA区段内，由3个外显子和其间的2个内含子组成，3个外显子的长度分别是126 bp、307 bp、11 bp。编码蛋白为15.845 kD、含有一个由148个氨基酸残基组成的开放阅读框架的单链多肽，具有4个沟回状重叠的空间构型，该结构特别是第4个重叠是保持p16基因的活性所必需的。

　　2　p16基因在胃癌中的表达及意义

　　国内外学者的研究结果表明，p16基因与胃癌分化、浸润、淋巴结转移及患者预后有显著的相关性，检测胃癌组织p16基因的各种变化，有助于对胃癌生物学行为的进一步了解和对患者预后的评估。

　　p16基因在胃癌中可发生纯合性缺失、5’端CpG岛异常甲基化、表达下降等3种形式的改变。纯合性缺失是指两个等位基因完全丢失，表现为PCR扩增无产物或Southern杂交信号完全消失。事实上，在已普查过的近300个癌细胞株中，p16基因最易发生纯合性缺失，可能的原因是另有抑癌基因在9p21上与之连锁，如p15基因。CpG岛是DNA的一段区域，长度约0.5～2.0 kb，富含GC，在正常组织中没有甲基化^〔5〕。p16基因常因转录启动区域5’-CpG岛异常甲基化而被灭活^〔5，6〕，表现为等位基因不转录或异常转录，应用逆转录嵌套式聚合酶链反应(RT-NPCR)法可测得异常转录物。

　　p16基因发现后不久，日本学者Igaki等^〔7〕就对9例胃癌细胞株进行了Southern杂交分析，发现4例低分化胃癌细胞株中有2例(22%)发生纯合性缺失，而高分化组未见缺失。Akama等^〔8〕用同法检查了8例胃癌细胞株，结果发现2例(25%)存在p16基因的纯合缺失，另有2例虽未测得基因改变，但均未表达p16，考虑存在5’-CpG岛异常甲基化。吕有勇等^〔9〕检测5株胃癌细胞系，有1株(20%)存在p16基因纯合缺失，另有2例未见明显的基因丢失，但没有表达或表达下调；在85例胃癌组织中，14例(16.4%)存在p16基因纯合缺失，这些缺失的病例都属于低分化、有淋巴结转移的进展期胃癌，提示p16基因结构和表达异常与胃癌分化、转移相关。前不久，Chen等^〔10〕运用RT-NPCR方法检测了10例肠型胃癌、11例弥漫型胃癌，结果分别发现3例(30%)和5例(45.5%)中存在异常p16 mRNA转录物，其中大多数有外显子1和外显子2的核苷酸序列的部分缺失，认为RT-NPCR法是检测小的基因内缺失的有效方法，异常p16 mRNA转录物在胃癌中属频发事件。另外，国内学者进行的大量胃癌中p16蛋白表达的研究充分显示，p16蛋白在胃癌组织中表达明显降低，且与胃癌分化、浸润、淋巴结转移、患者预后明显相关^{〔11，12〕}。

　　3　p16基因的生物学作用

　　研究表明，细胞癌变与细胞周期失控密切相关，典型的一个细胞周期包括有顺序严格的4个期即G₁→S→G₂→M。细胞周期进行的关键在于CDK_s的活化，而CDK_s受细胞周期素(cyclin)及其抑制蛋白的正负调节。已发现的8种cyclin中，尤以cyclin d家族对细胞增殖具有最重要的意义，实验表明，阻滞cyclin D的表达使细胞不能从G₁期→S期，而其过表达则使G₁期缩短^〔13〕。cyclin d包括D₁、D₂、D₃三个亚型，分别在不同的细胞系中表达。cyclin d₁与CDK_4/6结合形成复合物，能使视网膜母细胞瘤易感基因(即Rb基因，为一种抑癌基因)的蛋白产物PRb磷酸化，进而激活某些转录活化因子如E₂F(异源双体转录子)，E₂F则能活化DNA合成基因和细胞生长控制基因，启动DNA合成，使细胞由G₁期进入S期^〔14〕。而p16蛋白则为CDK_4/6抑制剂，对CDK_4/6有高度亲和性，在细胞增殖的调控中，p16蛋白与cyclin d₁竞争与CDK_4/6结合，发挥负性调节作用，共同完成对细胞增殖周期的调控^〔15〕。因此，当p16基因发生改变，在肿瘤组织中表达异常时，则有可能导致肿瘤发生、进展。

　　4　p16基因与癌基因cyclin D₁及抑癌基因Rb的关系

　　cyclin D₁对细胞增殖具有重要意义，其过度表达会导致细胞增殖失控，因而被认为是一种癌基因^〔16〕。实验上，胃肠癌、乳癌、食管癌以及B细胞淋巴瘤中都有cyclin d₁的过表达^〔17〕。Rb基因则是经典的，也是最早发现的抑癌基因，cyclin d₁、Rb基因对p16基因的调控具有重要的意义。

　　Shapiro等^〔18〕应用免疫组化和免疫印迹分析技术分别对PRb阳性占多数的非小细胞肺癌(NSCLC)和PRb阴性的小细胞肺癌(SCLC)的手术标本及细胞系进行了测定，结果显示PRb(+)的NSCLC几乎没有p16表达，而PRb(-)的SCLC则有高丰度的p16表达。Tam等^〔19〕在体外转化细胞中的研究也得到相类似的结果，发现p16表达与Rb表达呈负相关。推测其可能机理是CDK在某些情况下被激活，如当p53失活或表达下调引起p21随之下调，激活了CDK，使Rb蛋白磷酸化而失活，Rb蛋白的抑制作用减弱，从而使p16蛋白表达代偿性增加，导致cyclin d₁活性下降。p16的激活与cyclin D₁的下调反过来抑制CDK的活性。因此，cyclin d₁、Rb、p16和CDK共同组成了一个反馈调节圈。对细胞周期的研究发现，在生理情况下，在G₁→S期的转化早期，cyclin d₁水平增高，随G₁→S期的转化，活化的cyclin D₁/CDK₄复合物渐趋失活，而此时p16表达达到高峰(失活的PRb通过转录因子E₂F促进p16转录)，p16反过来又抑制cyclin d₁对CDK_4/6的活化作用，当Rb基因突变或缺失或cyclin d₁的过表达超出了p16基因的代偿能力时，细胞周期调节失控，细胞过度增殖导致癌变^〔3〕。

　　综上所述，由于p16基因与胃癌发生、进展有密切关联，其作用机理为直接抑制细胞周期，且p16基因分子量小，易于标定，用p16基因作靶分子进行基因操作或蛋白修饰，均比p53简单易行。因此，已有学者将外源性p16基因导入有p16基因表达异常的人胃癌细胞株中。结果显示，导入外源性p16基因对胃癌细胞系PAMC82的裸鼠致瘤性有十分明显的抑制作用^〔20〕。另外，由于p16基因与Rb、cyclin d₁等共同参与了细胞增殖周期的调节，因此，对p16基因的深入研究，对于阐明细胞周期演进的分子调节，乃至整个生命活动过程的调节，均具有重要的意义。

　　作者单位：刘　君　蒲永东　解放军第309医院普外科(北京　100091)

　　宋少柏　北京解放军总医院普外科

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