MDM2和p53基因蛋白在急性白血病细胞中表达及与化疗反应的关系

中华血液学杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：林茂芳　刘艳春　金洁

单位：310003　杭州，浙江医科大学血液病研究所

　　关键词： 急性白血病；癌基因，MDM2；抗癌基因，p53

　　摘要　目的：研究人急性白血病(AL)细胞MDM2及p53基因蛋白表达水平、它们的相互关系及对AL化疗反应预测的价值。方法：免疫组化方法检测MDM2及p53蛋白。结果：①46例AL细胞MDM2蛋白阳性率为71.7%，p53蛋白阳性率为21.7%，无细胞类型不同的差别(P＞0.05)，复发难治组比初发未治组约高1倍；②MDM2与p53蛋白呈反向表达者多见，以MDM2(+)，p53(-)方式表达(67.4%)高于同向方式表达(15.2%)(P＜0.01)；③MDM2蛋白阴性者骨髓缓解(BMR)率(69.2%)高于阳性者(33.3%)(P＜0.05)，两种蛋白不同表达关系对化疗效应有影响；④AL患者4例中2例化疗后MDM2蛋白转阴性，获BMR，另2例则反之。结论：人AL细胞MDM2蛋白阳性率高，p53蛋白阳性率低；在同一AL细胞中两者多呈反向表达，且不同表达方式对化疗有影响；在AL细胞中确实存在MDM2(+)，p53(-)表达方式。MDM2蛋白，特别是MDM2蛋白与p53蛋白联检可能预测AL细胞对化疗的敏感性。

　　Study on MDM2 and p53 gene proteins expression on acute leukemic cells and its correlation with chemotherapeutic efficacy　Lin Maofang, Liu Yanchun, Jin Jie.First Affiliated Hospital,Zhejiang Medical University, Hangzhou　310003

　　Abstract　Objective:To explore MDM2 and p53 gene proteins expression on human acute leukemia (AL) cells and their predictive value for chemotherapeutic efficacy. Methods:MDM2 and p53 gene proteins expression was assayed by immunohistochemical staining. Results:①The expression rates of MDM2 and p53 gene proteins were 71.7% and 21.7% respectively in 46 AL patients. The rates were slightly higher in relapse/refractory AL than in previously untreated AL; there was no difference among AL subtypes. ②MDM2^＋ and p53^- accounted for 67.4%, while the uniform expression of MDM2 and p53 15.2% (P＜0.01). ③The marrow complete remission (CR) rate (69.2%) of MDM2^- patients was higher than that (33.3%) of MDM2⁺ patients (P＜0.05). ④Two of 4 patients with MDM2⁺⁺⁺ gained CR and then MDM2 turned negative. Conclusion: MDM2 gene protein was negatively related with p53 gene protein in AL cells. Different expression patterns of the two gene proteins could influence the therapeutic efficacy, and combined detection of the two may be used as a prognostic parameter for AL patients.

　　Key words　Leukemia,acute　　Oncogene, MDM2　　Antioncogene, p53

　　MDM2(Murine Double Minute 2)是p53基因的拮抗基因，它编码的一种DNA结合蛋白p90与p53基因蛋白(p53蛋白)形成复合体致p53基因失去抑癌功能^［1］。我们对46例急性白血病(AL)患者白血病细胞MDM2蛋白表达水平及其与p53蛋白共表达方式对化疗效果的影响作了初步研究，以探讨人类白血病细胞MDM2蛋白异常表达以及其与p53蛋白在AL的病情变化及化疗反应中的关系。

病例和方法

　　1　研究对象　46例AL患者包括初发未治33例，复发或难治13例，其中急性非淋巴细胞白血病(ANLL)34例(M₁2例，M₂8例，M₃3例，M₄1例，M₅18例，M₆2例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)12例。男28例，女18例，中位年龄40岁(14～63岁)。对照组取非白血病(NL)且骨髓象正常者骨髓10份。ANLL用HA(高三尖杉酯碱、阿糖胞苷)或DA(柔红霉素、阿糖胞苷)方案；ALL用VDCP(长春新碱、柔红霉素、环磷酰胺、泼尼松)方案治疗，部分难治或复发者加用足叶乙甙(Vp 16)^［2，3］。对4例AL患者作动态观察。初发患者两个疗程后的第2周末作骨髓液涂片检查，将白血病细胞比例＜0.05定为骨髓缓解(BMR)。

　　2　实验方法　无菌操作取抗凝骨髓液2ml或外周血4ml（WBC＞20×10⁹/L，白血病细胞占0.70以上），分离单个核细胞(MNC)，调细胞浓度为2×10⁹/L，白血病细胞占0.90以上，台盼蓝染色细胞活度 ≥0.95。取50μl细胞悬液滴于防脱胶处理的玻片上，37℃干燥，冷丙酮固定10分钟，置-70℃保存。NL对照标本以同法制备。

　　2.1　免疫组化方法按SP试剂盒说明操作。标本置0.3%双氧水甲醇液30分钟，然后依次加10%马血清、Ⅰ抗［鼠抗人MDM2单克隆抗体(单抗)或鼠抗人p53单抗，1∶50稀释，Santa Cruz产品］、生物素标记Ⅱ抗(A、B液1∶100)及SP复合物(1∶100稀释)，最后滴加新配的0.05% DAB液于涂片，在光学显微镜下观察5～15分钟(室温显色)，苏木素复染。以大肠腺癌阳性病理切片为p53蛋白阳性对照，淋巴结炎阳性病理切片为MDM2蛋白阳性对照；阴性对照以PBS代替Ⅰ抗。NL对照取已制备的标本。结果判定参考文献［4,5］。p53蛋白阳性信号为核黄色或棕色。计数500个白血病细胞，阳性细胞数＜5%为(－)；5%～20%为(＋)；21%～40%为(++)；＞40%为强阳性(+++)。本法检测突变型p53蛋白。MDM2蛋白阳性信号为核染黄色，按染色强度，无着色为(－)；淡黄色为(+)；黄色为(++)；深黄或棕褐色为强阳性(+++)。

　　2.2　基因蛋白表达水平、相互关系及与临床诸因素之间关系的统计分析，采用Spss 6.0 for win软件包。

结　　果

　　1　NL对照组10份骨髓MNCs中MDM2和p53蛋白均阴性。MDM2和p53蛋白在AL细胞及不同细胞类型中的表达结果见附表，两种蛋白在ANLL和ALL细胞阳性率虽有差异，但无统计学意义(P均＞0.05)。MDM2蛋白在急性单核细胞白血病(AMoL)与急性粒细胞白血病(AGL)(M_1～3)细胞阳性率无明显差异。3例急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞中p53蛋白均阴性。MDM2蛋白在初发未治和复发难治AL细胞总阳性率差异不大，但在难治复发AL细胞MDM2蛋白强阳性表达水平比初发未治AL细胞高约1倍。

附表　MDM2及p53基因蛋白在AL细胞的表达

　　*仅包括FAB分型中M_1～32　MDM2与p53蛋白表达的关系　在同一患者的AL细胞中，两者呈反向表达的有39例(84.8%)，两者同向表达有7例(15.2%)(P ＜0.01)。在AL细胞MDM2呈高表达，而p53蛋白呈低表达。

　　3　AL患者MDM2蛋白阳性表达与对化疗反应的关系　MDM2蛋白阴性的13例中9例获BMR，而阳性表达的33例中仅11例获BMR，两者差异具有统计学意义(P＜0.05)。在初发未治组，MDM2蛋白阴性9例中8例获BMR；在复发难治组MDM2蛋白阴性的4例中仅1例获BMR(P＜0.05)。反向表达中以MDM2蛋白阳性，p53蛋白阴性方式表达的BMR率(41.9%)高于以MDM2蛋白阴性，p53蛋白阳性方式表达的BMR率(25.0%)(P＞0.05)。两种蛋白都阳性者均NR；两者都阴性者均获BMR。4例AL患者在化疗前，MDM2蛋白均为强阳性，经两个疗程化疗后，2例获BMR的AL细胞中MDM2蛋白转为阴性，另2例化疗无效的AL细胞中MDM2蛋白仍为强阳性。

讨　　论

　　MDM2蛋白已知至少有10种，很可能系转录或转录后修饰所致^［6］。体内只有MDM2蛋白p90和p57能与p53基因蛋白形成复合体使之失去与靶DNA结合的能力，细胞内p90/p53比率决定细胞的最终状态。MDM2是p53的拮抗基因，这种作用发生在蛋白质水平，MDM2过度表达将会产生类似p53基因点突变失活的效应。MDM2与p53相互作用的方式有下列四种可能性：①形成p53-p90复合体，p90结合于p53 N端AA_1～159区域，影响p53转录激活；②MDM2通过与T抗原结合或单独以类似T抗原方式与p53结合；③通过旁路调节途径影响p53的调节功能；④MDM2可能具有结合DNA的能力，直接作用于靶DNA，对抗p53的效应。有报道，慢性粒细胞白血病急性变时，有p53基因改变且伴有MDM2扩增，提示二者可能在疾病恶化过程中起协同作用^［7］。

　　Bueso-Ramos等^［8］用免疫组化方法检测AL细胞MDM2蛋白阳性表达率为72.2%，ANLL细胞为82.0%，ALL细胞为57.0%。Marks等^［9］研究的难治性ALL 10例中4例有MDM2蛋白过度表达，仅2例有mRNA高表达，提示MDM2蛋白表达比mRNA水平的异常更常见。本组资料显示MDM2蛋白在AL及其亚型细胞阳性表达水平与文献符合，但未发现在M₄、M₅亚型中高表达，可能与病例数少有关。此外，复发难治AL细胞MDM2蛋白阳性率高于初发未治细胞，提示AL细胞对化疗敏感性可能与MDM2有关。

　　Maestro等^［10］报道，在淋巴瘤细胞中有MDM2、p53蛋白均阳性，均阴性及MDM2蛋白阴性，p53蛋白阳性三种形式。我们的结果与Seliger等^［5］分析的结果相同，证明在白血病细胞中尚有MDM2蛋白阳性，p53蛋白阴性的第四种形式，且在本组AL中占67.4%，非常明显地多于其它的形式。表明在AL细胞，MDM2和p53蛋白之间以反向表达关系为主。

　　本组资料显示，MDM2蛋白阳性者BMR率(33.3%)显著低于阴性者(69.2%)(P ＜0.05)；在复发难治组，MDM2蛋白强阳性较在初发未治组多见，前者的BMR率(25.0%)低于后者(66.7%)(P＜0.05)。提示MDM2蛋白测定可以作为评价化疗反应的一种指标。本组结果还显示，MDM2与p53蛋白以不同方式表达对化疗效果也有影响。MDM2蛋白阳性，p53蛋白阴性者的BMR率(41.9%)高于MDM2蛋白阴性，p53蛋白阳性者的BMR率(25.0%)；MDM2与p53蛋白都阳性表达者均NR，两种蛋白均阴性时，全部获BMR。提示两种基因蛋白联合检测可能有助于评估AL细胞对化疗的敏感性。

参 考 文 献

　　1　Momand J, Zambetti GP, Olson DC, et al. The mdm-2 oncogene product forms a complex with p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell, 1992，69:1237-1245.

　　2　全国白血病化学治疗讨论会纪要*急性白血病疗效标准.中华血液学杂志，1988,9:183-184.

　　3　陆道培主编．白血病治疗学．北京：科学出版社，1992. 92-93．

　　4　Bartek J, Bartkova J, Lukas J, et al. Immunohistochemical analysis of the p53 oncoprotein on paraffin sections using a series of novel monoclonal antibodies. J Pathol,1993,169:27-34.

　　5　Seliger B, Papadileris S, Vogel D, et al.Analysis of the p53 and MDM2 gene in acute myeloid leukemia. Eur J Haematol, 1996,57:230-240.

　　6　Bueso-Ramos CE, Manshouri T, Haidar MA, et al. Multiple　patterns of MDM2 deregulation in human leukemias: implications in leukemogenesis and prognosis. Leuk Lymph, 1995,17:13-19．

　　7　Schafer-Witte P. Genetic analysis of p53 and MDM2 in blast crisis of chronic myelogenic leukemia. Ann Hematol, 1993, 67(Suppl):A106-111.

　　8　Bueso-Ramos CE, Yang Y, de Leon E, et al. The human MDM2 oncogene is overexpressed in leukemias. Blood, 1993,82:2617-2623．

　　9　Marks DI, Kurz BE, Link MP, et al. High incidence of potential p53 inactivation in poor outcome childhood acute lymphoblastic leukemia at diagnosis. Blood, 1996,87:1155-1161.

　　10　Maestro R, Gloghini A, Doglioni C, et al.MDM2 overexpression does not account for stabilization of wild-type p53 protein in non-Hodgkin's lymphomas. Blood,1995,85:3239-3246.

(收稿：1997-07-14　　修回：1998-01-23)

(校对：王叶青)