早期胃癌cyclin E表达的生物学意义

世界华人消化杂志 1999年第1期第0卷 专家评述

作者：黎家庆　万远廉　才文彦

单位：北京医科大学第一医院普外科　北京市　100034

关键词：胃肿瘤/病理学；p53基因；细胞周期素E；免疫组织化学

　　中国图书资料分类号　R735.2

　　摘　要

　　目的　研究早期胃癌cyclin E表达的生物学意义.

　　方法　用免疫组化法检测108例早期胃癌组织中cyclin E和P53的表达.

　　结果　正常胃腺体细胞几乎不染色，33%(36/108)的胃癌呈棕黄色. Cyclin E的总阳性率，在幽门部为48%(24/50)，肉眼观混合型46%(6/13)，组织学分化型40%(31/78)，P53阳性者54%(19/35)，均显著高于对照组. Cyclin E的强阳性率，在癌侵入粘膜下者是18%(9/51)，侵入静脉者28%(5/18)，侵入淋巴管者28%(9/32)，侵入淋巴结者30%(4/13)，都显著高于对照组. Cyclin E强阳性者五年生存率40%(4/10)，显著低下.

　　结论　Cyclin E阳性尤其是强阳性者恶性程度高.

Biological significance of cyclin E

　　expression in early gastric cancer

LI Jia-Qing, WAN Yuan-Lian and CAI Wen-Yan

　　Department of General Surgery, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China

　　Subject headings　stomach neoplasms/pathology; p53 gene; cyclin E; immunohistochemistry

　　Abstract

　　METHODS　The expression of cyclin E and P53 was examined by immunohistochemical method in 108 cases of early gastric cancers.

　　RESULTS　Normal gastric epithelial cells were almost not stained, while 33% (36/108) of early gastric cancers were stained brown-yellow. Total positive rate of cyclin E was 48% (24/50) in antrum, 46%(6/13) in mixed type of gross examination, 40% (31/78) in differentiated type and 54% (19/35) in P53 positive tumors; and they were significantly higher than the control groups. Strongly positive rates of cyclin E were: tumors invading submucosa, 18% (9/51); those invading venous vessel, 28% (5/18); those invading lymphatic vessel, 28% (9/32); and those invading lymph node, 30% (4/13): they were significantly higher than their control groups. The 5-year survival rate was 40% (4/10) in patients with strong positive cyclin E.

　　CONCLUSION　The cyclin E positive especially strongly positive tumors have much higher malignancy, its expression can help discern the biological nature of early gastric cancer.

　　0　引言

　　细胞周期素E(cyclin E)，周期素依赖激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK₂)和CDK抑制者在细胞G₁晚期分别促进和抑制G₁向S期过渡. Cyclin E是一种G₁期核蛋白，它结合并激活CDK₂而直接促进G₁/S过渡. 野生型p53通过激活能抑制CDK功能的P21蛋白而间接抑制这种过渡. 故cyclin E与p53的过度表达将使G₁/S过渡失调，有可能引起无限制地细胞增殖^［1］. Cyclin E在基因、mRNA和蛋白水平的过度表达与不良预后有关^［2］，证实它参与和促进了乳癌的进展，并有助识别乳癌的生物学特性. Cyclin E也促进了胃癌的发生^［3］，有可能用于识别早期胃癌的生物学特性. 但国内外至今未见有关报道. 现探讨cyclin E过度表达在识别早期胃癌生物学特性中的作用.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　取1979/1992年间在日本鹿儿岛大学医学院连续手术切除的早期胃癌108例；其中，男79例，女29例. 平均年龄63(31～85)岁. 标本经福尔马林固定，石蜡包埋. 每例标本都选择了既包括肿瘤中心又含肿瘤边缘的石蜡块1个，制成3张3μm的连续切片后分别经抗cyclin E，抗p53单克隆抗体(mAb)和HE染色. 早期胃癌临床病理特征的诊断依据《日本胃癌研究的一般规则》第12版. 肉眼观类型分为：隆起型，凹陷型及此二者的混合型. 组织学类型分为：分化型，包括乳头状和管状腺癌；未分化型，包括印戒细胞癌、粘液和低分化腺癌.

　　1.2　方法　免疫组化染色，药盒为Histofine (Nichirei公司，日本)产品. 二甲苯脱蜡后的组织切片经酒精水化后浸入3mL/L的双氧水中30min以阻断内源性氧化酶的活性，然后在0.01mol/L、pH 6.5、100℃的柠檬酸缓冲液内加热30min以充分暴露抗原. 4℃分别经抗cyclin E mAb(Santa Cruz生物技术公司，1∶600倍稀释)和抗P53 mAb(Transduction实验室，美国，1∶500倍稀释)孵育至少12h后，室温下切片再分别与兔抗鼠血清反应20min，过氧化酶复合物反应15min. 随后cyclin E及P53染色经二胺基联苯胺四盐酸盐分别显色2和5min，再经苏木精复染1min，脱水、透明、封片. 每张切片选择5个不同的代表性区域(即切片的中心及上、下、左、右四边)分别进行细胞计数. 每区计数200，5区共1000个细胞，计算染色细胞所占比例. Cyclin E的染色结果分为：阴性(-)，染色细胞数＜5%；阳性(+)，染色细胞数5%～50%；强阳性(++)，染色细胞数＞50%^［1，5］. P53分为：阴性(-)，染色细胞数＜5%；阳性(+)，染色细胞数＞5%.

　　统计学处理　采用Statview 4.5版统计软件. Cyclin E表达与年龄和肿瘤大小的关系用H检验，与其他临床病理特征和P53的关系用χ²检验，与预后的关系用Kaplan-Meier检验.

　　2　结果

　　2.1　癌组织中cyclin E的表达　正常胃粘膜上皮细胞几乎不被抗cyclin E mAb染色. 血管内皮细胞质和淋巴细胞质都呈轻度棕黄色，但两种细胞的胞核均不染色(图1). 胃癌上皮细胞中棕色的免疫反应位于细胞核内，且染色细胞分布不均匀(图2). 早期胃癌染色的总阳性率为33%(36/108，表1)，其中阳性率为24%，强阳性率9%.

图1　正常胃粘膜上皮细胞几乎不被抗cyclin E mAb染色. 血管内皮细胞质和淋巴细胞质都呈轻度棕黄色　×400

图2　胃癌上皮细胞核内cyclin E染色呈棕色的免疫反应，染色细胞分布不均匀　×400

　　2.2　临床病理特征与cyclin E的关系　早期胃癌中cyclin E阳性组和强阳性组的肿瘤都倾向小于阴性组. 总阳性率男高于女. 幽门部、肉眼观混合型和组织学分化型中cyclin E的总阳性率均显著增高. 早期胃癌侵入粘膜下层、静脉、淋巴管、淋巴结者，其cyclin E的强阳性率都显著增高(表1). p53阳性组比阴性组显著频繁地表达cyclin E(表1). Cyclin E强阳性的患者五年生存率(4/10, 40% vs 阳性者22/25， 88%和阴性者64/71， 90%)显著较低.

表1　早期胃癌cyclin E与临床病理特征和P53表达的关系

临床病理特征		n	cyclin E表达
			阳性(%)	强阳性(%)
总计		108	26(24)	10(9)
肿瘤最长径	(, mm)		23±12*	19±8*
性别	男	79	22(28)	9(11)
	女	29	4(14)	1(3)
位置	喷门	27	3(11)	3(11)
	胃体	31	6(19)	0(0)
	幽门	50	17(34)	7(14)a
肉眼观类型	隆起	19	3(16)	3(16)
	混合	13	1(8)	5(38)b
	凹陷	76	22(29)	2(3)
组织学类型	分化	78	21(27)	10(13)a
	未分化	30	5(17)	0(0)
浸润深度	粘膜	57	13(23)	1(2)
	粘膜下	51	13(25)	9(18)a
淋巴管浸润	无	76	18(24)	1(1)
	有	32	8(25)	9(28)b
淋巴结转移	无	95	25(26)	6(6)
	有	13	1(8)	4(30)a
静脉浸润	无	90	22(24)	5(6)
	有	18	4(22)	5(28)a
P53表达	阴性	73	15(20)	2(3)
	阳性	35	11(32)	8(22)b

^aP＜0.05，^bP＜0.01，x²检验.

　　^*Cyclin E阴性组的平均值为31mm±19mm，H检验.

　　3　讨论

　　正常细胞内cyclin E是有顺序、按计划表达的： 合成开始于G₁中期，表达最高峰出现在细胞进入S期的时刻，降解发生在S期内；G₂和M期中无表达. 而CDK₂在整个细胞周期中均表达且水平无变化. 故cyclin E只能短时激活CDK₂. 异常细胞内cyclin E无顺序、无计划地过度表达，在整个细胞周期中含量过高， 可持续性地激活CDK₂去磷酸化底物，驱使细胞超越某些控制机制发生异常增殖. Cyclin E过度表达与细胞的肿瘤变形明显相关^［5］.

　　正常胃腺体上皮细胞几乎不染色表明正常情况下cyclin E的水平较低. 早期胃癌中cyclin E的总阳性率为33%，低于Yasui et al的59%^［1］. 此差异可能由两个因素引起：①晚期胃癌的cyclin E的总阳性率高于早期. Yasui et al的研究同时包含了早晚期病例，而本研究不包含晚期胃癌. ②我们发现他的实验条件(第一抗体稀释1∶200，二胺基联苯胺四盐酸盐显色5min)可导致假阳性，最佳(我们采用)条件为1∶600倍稀释，2min显色. 正常胃粘膜与癌之间的表达差异支持cyclin E过度表达参与了胃癌发生的结论^［1］.

　　我们采用免疫组织化学法在国内外首次观察到了6个重要现象，即：早期胃癌侵入粘膜下层、静脉、淋巴管、淋巴结者以及组织学分化型者cyclin E强阳性率或总阳性率显著较高， cyclin E强阳性者预后差. 因其表达可作为细胞增殖的指标^［6］，cyclin E的过度表达表明早期胃癌由粘膜层侵入粘膜下层时细胞增殖加速，与PCNA研究胃癌细胞增殖速度所得结论一致^［7］. Cyclin E过度表达的胃癌细胞增殖较快，细胞中cyclin E的过度表达可能超越有关cyclins-CDK反馈环而提供另外可使肿瘤细胞获得增长优势的机制^［8］，有cyclin E基因扩增的胃癌淋巴结转移率较高^［3］. Cyclin E强阳性者预后差可能与此类肿瘤细胞增殖快、深层浸润能力强、侵入静脉管和淋巴系统频繁有关，表明此类肿瘤生物学恶性程度高. cyclin E的过度表达主要出现在分化型胃癌进一步支持分化型与未分化型癌的细胞增殖机制可能有所不同的推论. Cyclin E的过度表达显著频繁地发生于幽门部、肉眼观混合型、男性可能与分化型胃癌多发生在幽门部、体积较小、多为男性有关，因为分化型胃癌的cyclin E表达率显著较高.

　　我们的实验条件下染色的很可能是突变型的p53，它丧失了野生型p53激活p21进而抑制cyclin E-CDK的功能，故P53阳性细胞增殖较快，浸润能力强. 我们在早期胃癌中观察到了cyclin E表达阳性者比阴性者频繁地表达P53. 此结果进一步支持cyclin E和p53之间可能存在某种关系的推论^［1，4］，并提示过度表达的cyclin E和P53之间可能能够相互促进，具有cyclin E和P53同时过度表达的胃癌可能增殖更快、恶性度更高.

　　致谢　日本鹿儿岛大学医学院第一外科爱甲孝教授提供的石蜡标本切片.

　　作者简介：黎家庆，男，1965-07-16生，云南省昆明市人，汉族. 1988年华西医科大学六年制医学学士，1993年北京医科大学外科学硕士，助理研究员，主要从事消化系肿瘤的细胞和分子生物学研究，发表论文15篇.

　　通讯作者　黎家庆，100034，北京医科大学第一医院普外科，北京市西什库大街8号.

　　Correspondence to:LI Jia-Qing, Department of General Surgery, The First Hospital, Beijing Medical University, 8 Xishiku Street, Beijing 100034, China

　　Tel. +86·10·66171122 Ext. 2207

　　4　参考文献

　　［1］　Yasui W, Akama Y, Kuniyasu H, Yokozaki H, Semba S, Shimamoto F，Tahara E.Expression of Cyclin E in human gastric adenomas and adenocarcinomas: correlation with proliferative activity and p53 status. J Exp Ther Oncol, 1996;1:88-94

　　［2］ Porter PL, Malone KE, Heagerty PJ, Alexander GM, Gatti LA, Firpo EJ, Daling JR, Roberts JM. Expression of cell-cycle regulators p27kipl and cyclin E, alone and in combination, correlate with survival in young breast cancer patients. Nature Med, 1997;3:222-225

　　［3］ Akama Y, Yasui W, Yokozaki H, Kuniyasu H, Kitahara K, Ishikawa T, Tahara E. Frequent amplification of the cyclin E gene in human gastric carcinomas. Jpn J Cancer Res, 1995;86:617-621

　　［4］ Yasui W, Kuniyasu H, Yokozaki H. Expression of Cyclin E in colorectal adenomas and adenocarcinomas: correlation with expression of Ki-67 antigen and P53 protein. Virchows Arch, 1996;429:13-19

　　［5］ Thenaa KS, Daniel M. Cell cyclins and cyclin-dependent kinase activities in mouse mammary tumor development. Carcinogenesis, 1995;16:823-830

　　［6］ Dutta A, Chandra R, Leiter LM, Lester S. Cyclins as markers of tumor proliferation: immunocytochemical studies in breast cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 1995;92:5386-5390

　　［7］　许庆文，李岩松，朱荷根. 大肠癌P53蛋白PCNA和CEA的表达与淋巴结转移的关系. 世界华人消化杂志，1998；6：244-246

　　［8］　Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z. Threshold expression of cyclin E but not D type cyclins characterizes normal and tumor cells entering S phase. Cell Prolif, 1995;28:337-346

收稿日期　1998-07　07