转染Caspase-1基因对人胃癌细胞株生物学特性影响的研究

中国胃肠外科杂志 1999年第4期第2卷 论　著

作者：薛绪潮　方国恩　钱其军　闻兆章　毕建威　沈炎明

单位：第二军医大学附属长海医院普通外科(薛绪潮，方国恩，闻兆章，毕建威，沈炎明)；东方肝胆外科医院免疫治疗中心(钱其军)

　　关键词： 细胞凋亡；Caspase-1基因；逆转录病毒载体；胃癌细胞；基因治疗

　　【摘要】　目的　探讨转染Caspase-1基因对胃癌细胞生物学特性的影响。方法　将人凋亡基因Caspase-1的重组逆转录病毒导入胃癌细胞株X-108，对转染阳性细胞的体外增殖、细胞培养液中CEA含量及裸鼠致瘤性进行分析。结果　导入的Caspase-1基因使细胞增殖周期发生变化，G₁期细胞数目增多，S期细胞数目减少。转染细胞培养液CEA含量有下降趋势。胃癌细胞株X-108- Caspase-1体外生长速度明显受抑，裸鼠体内致瘤性降低，肿瘤生长缓慢。结论　Caspase-1 不能促使X-108胃癌细胞凋亡，但可以使其增殖受抑，肿瘤细胞的恶性程度降低。

Biological characteristics of the human gastric cancer

　　cell line transfected with Caspase-1 gene

XUE Xuchao，FANG Guoen，QIAN Qijun，et al. Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433

　　【Abstract】　Objective　To investigate the biological characteristics of human gastric cancer cell transfected with Caspase-1 gene.Methods　Recombinant retroviral vector with human Caspase-1 cDNA was transferred into human gastric cell line X-108. The proliferation tumorigenicity, cycle of the delivered cell line and the CEA concentration in the supernate of cell culture were analyzed respectively.Results　Apoptosis was not induced， but the cell number of G₁ stage increased, and of S stage decreased. CEA concentration in supernate also decreased. The proliferation and the tumorigenicity of the gastric cancer cell line transfected with Caspase-1 gene were considerably inhibited.Conclusion　Though apoptosis of the gastric cancer cell line X-108 transfected with Caspase-1 gene is not induced， the proliferation is inhibited.

　　【Key words】　Apoptosis　Caspase-1 gene　Retroviral vector　Human gastric cell line　Genetherapy

　　胃癌发病隐匿，早期无明显症状，临床上发现时大多已届中晚期，手术根治率低，术后复发率高，且对化疗的敏感性差。因此研究胃癌发生发展的变化规律，探索胃癌治疗的新途径，成为我国肿瘤研究的当务之急。本研究根据恶性肿瘤的产生与发展不仅细胞增殖过强、而且细胞凋亡减弱的机制，于1998年1月至1999年4月，应用被认为是调节哺乳动物细胞凋亡的关键基因Caspase-1^［1］，又称ICE基因(interleukin-1β converting enzyme gene)，转染人胃癌细胞株，以观察目的基因在人胃癌细胞中的表达及其对胃癌细胞株生物学特性影响的研究，探索凋亡基因治疗胃癌的可行性。

　　材料与方法

　　一. 质粒、细胞及主要试剂

　　人pGEM-4-Caspase-1质粒由美国Michaek J Tocci博士惠赠，逆转录病毒载体pLXSN由美国CWRU大学肿瘤免疫基因治疗室提供。X-108人胃癌细胞株由本院自建，包装细胞系PA317由上海东方肝胆医院免疫基因治疗中心提供，人Caspase-1及内对照GAPDH的RT-PCR引物由中国科学院上海生物化学研究所合成。

　　二. 人Caspase-1重组逆转录病毒载体的构建及导入包装细胞

　　人基因Caspase-1 cDNA全长为1361 bp，其HindⅢ及EcoRⅠ酶切点分别为407 bp及0 bp。pLXSN经EcoRⅠ酶切，去磷酸化，然后与人全长Caspase-1 cDNA连接进行重组, 采用电穿孔法，将pLXSN-Caspase-1及空载体pLXSN分别转染细胞PA317，经G418筛选获得抗性克隆,进行培养。

　　三. 转染基因人胃癌细胞株X-108-Caspase-1的建立

　　取相应病毒上清0.5 mL过滤，加入胃癌细胞株内，再加1∶100稀释的polybrene 8 μg/mL，37℃孵育4小时，然后换液去除polybrene，48小时后G418(600 μg/mL)筛选,收集G418抗性克隆。

　　四. 鉴定外源基因导入的RT-PCR分析

　　细胞总RNA提取采用德国QIAGEN公司试剂盒，RNA定量采用紫外分光光度法，反转录采用GIBCO BRL公司试剂盒检测目的基因Caspase-1的存在。

　　PCR引物:人ICE 5'-引物为AAAGCCATGGCCGACAAGGTCCT

　　3'-引物为TTATTTTAATGTCCTGGAAGAGG；

　　内对照GAPDH 5'-引物为GCAATGTGCATGTGTCTGTG

　　3'-引物为TTACCCAGGCTGAGTACTGCT；

　　五. 细胞周期的测定

　　参照Dannova^［2］方法，测定细胞DNA含量的变化，以0.5%胰酶-EDTA液消化，收集未转染、空载及转染基因的贴壁细胞，离心去上清，边震荡边滴入冷70%乙醇固定，4℃保存，上机前PBS洗涤3次，加入适量PBS液与含RNA酶的碘化丙锭（PI）染液混匀，4℃，30分钟，经45目尼龙网滤过后，调整细胞浓度至10⁶/mL，流式细胞仪（FCM）测定亚二倍体细胞DNA含量变化。

　　六. 培养细胞上清液CEA放免检测

　　将培养瓶中有X-108、X-108-pLXSN及X-108-pLXSN-Caspase-1细胞贴壁生长的培养液（1×10⁴/mL）中取出100 μL测定培养液中的CEA，每份测3个复管。

　　七. 细胞生长曲线的测定

　　取生长良好的细胞消化，调整细胞浓度为5×10³/mL，铺96孔板，每孔0.2 μL，每24小时每株细胞取3孔计数，取平均值。

　　八. 裸鼠致瘤性分析

　　BALB/c裸鼠18只，随机分为3组，每组6只，分别在皮下接种注射X-108、X-108-pLXSN及X-108-pLXSN-Caspase-1细胞株，细胞浓度为1×10⁷/mL。连续观察肿瘤出现时间和体积，6周后处死动物称取瘤重。

　　九. 统计学分析

　　各组间裸鼠成瘤率采用χ²检验，肿瘤重量及生长曲线间比较均采用方差分析。

　　结　果

　　一. pLXSN-Caspase-1的构建及鉴定

　　经EcoRI酶切，其电泳带为1361 bp及5874 bp，为进一步鉴定ICE插入的方向，经HINDⅢ酶切，其电泳带为1317 bp及5918 bp，证实Caspase-1 cDNA正向插入pLXSN中（图1）。

图1　pLXSN-Caspase-1重组逆转录病毒载体的酶切鉴定

　　lane M:λgt/HindⅢDNA markers；lane1:pLXSN-Caspase-1/EcoRⅠ；

　　lane 2: pLXSN-Caspase-1/HindⅢ

　　二. 逆转录病毒上清转染X-108细胞株阳性克隆的获得及鉴定

　　转染人Caspase-1基因的X-108-Caspase-1细胞株克隆形成明显少于转染空载体X-108-neo的细胞，但细胞形态未观察到有明显差异，将收集到的阳性克隆混合培养，进行RT-PCR分析，从基因组中，扩增到特异性的外源性人Caspase-1基因片段（约1.3 kb），提示目的基因已整合至靶细胞基因组中（图2）。

图2　RT-PCR反应扩增Caspase-1基因片断

　　lane M: λgt/HindⅢ DNA markers；Lane 1: Caspase-1-pGEM-4 plasmid.；lane 2: X-108；lane 3: X-108-neo；lane 4: X-108-Caspase-1；lane 5: SGC-7901

　　三. 流式细胞仪测定结果

　　流式细胞仪分析表明，未转染细胞株和空载细胞株细胞周期未发生明显变化；转染Caspase-1基因的细胞株组细胞周期发生了变化，G₁期细胞明显增多，S期的减少，两组间比较有明显差异（P＜0.01）。

　　1. CEA测定结果　见表1。

表1　各细胞株培养上清CEA值

　　2. 细胞体外生长速度　如图3所示，X-108-Caspase-1细胞株体外生长速度明显低于对照细胞株X-108和X-108-neo。

图3　细胞生长曲线分析

　　四. 裸鼠成瘤情况

　　X-108和X-108-neo细胞接种后平均10.4天，即见裸鼠背部皮下肿瘤结节形成，成瘤率6/6，X-108 ICE接种细胞后，14.5天有肿瘤形成， 4/6裸鼠出现肿瘤，与对照组相比，肿瘤生长速度明显减慢（图4）。接种6周后处死动物，称取肿瘤重量，X-108和X-108-neo细胞株所致瘤分别重为(4.8±0.5)g和(4.4±0.6)g，比较接近，X-108-Caspase-1细胞株所致瘤重为(1.8±0.4)g，明显低于前两组(P＜0.001)。

图4　胃癌细胞接种裸鼠后生长曲线

　　讨　论

　　近年来随着对细胞凋亡分子机制的深入研究表明，肿瘤的发生不仅有细胞增殖分化的异常，同时也有细胞凋亡的异常^［3］。Caspase-1是一种半胱氨酸酶，它广泛存在于细胞浆中，它使白细胞介素-1β前体裂解形成有生物活性的白细胞介素-1β，在炎性反应中有重要作用；1993年Yuan等^［4］报道人及小鼠Caspase-1与线虫凋亡关键基因CED-3所编码的蛋白时，发现两者的功能结构很相似，两者为同源基因， Caspase-1的氨基酸序列与直接参与CED-3有28%是相同的；进一步研究表明，转染 Caspase-1基因可直接诱导大鼠RT-1成纤维细胞和鸡背根神经元细胞的凋亡^［5，6］，还可参与Fas介导的细胞凋亡， Caspase-1缺失、突变或其特异性抑制剂牛痘病毒基因CrmA编码的蛋白可使Fas介导的细胞凋亡阻断，被认为是哺乳类动物细胞的凋亡的关键基因^［1］；Kondon等^［7］用顺铂诱导人脑胶质瘤细胞的凋亡，也证实是由于顺铂促进Caspase-1 mRNA的过度表达所致，因此设想采用促使胃癌细胞Caspase-1基因表达增加的方法，可能是肿瘤治疗的新途径。

　　本研究采用已被美国FDA批准用于临床的逆转录病毒载体pLXSN，将人Caspase-1基因的全长cDNA导入人胃癌细胞株，经RT-PCR分析，证实Caspase-1基因已在靶细胞中表达。肿瘤细胞增殖和裸鼠致瘤性的实验结果表明，受转染的胃癌细胞株体外生长速度明显受抑，裸鼠体内致瘤性下降，而且肿瘤生长明显减慢。流式细胞学分析表明，受转染细胞株细胞周期发生变化，G₁期细胞增多，S期细胞减少，而没有出现典型的凋亡峰。这可能一方面与该胃癌细胞株对Caspase-1介导的细胞凋亡有耐受现象，凋亡阈值较高有关；另一方面与该胃癌细胞本身失去启动Caspase-1表达的能力，再者可能与我们应用的目的基因是Caspase-1的全长cDNA，而不是Caspase-1基因的活性片断有关。 CEA是一种消化道恶性肿瘤常见的标志物，胃肠道发生肿瘤时血清CEA水平上升，常被用作消化道肿瘤的诊断及治疗效果的判断和复发的监测。本实验检测培养细胞上清液中CEA表明，受转染细胞株CEA分泌量也有下降。说明通过转染人Caspase-1基因，可使胃癌细胞的恶性特性发生改变，细胞增殖能力受到抑制。

　　胃癌发生的原因极其复杂，难以从单一方面阐明其发生的机制。本实验从凋亡的方面证实了胃癌的发生存在有细胞凋亡的异常，通过凋亡基因的导入可改变胃癌的遗传性状，使恶性增殖的特性受到了抑制，并为进行胃癌基因治疗的临床前研究提供了实验依据。

　　参考文献

　　1　Kumar S.ICE-like proteases in apoptosis. Trends Biochem Sci 1995；20:198-202.

　　2　Danova M，Giordano M，Mazzini G. Expression of P53 protein during the cell cycle measured by flow cytometry in human leukemia.Leuk Res 1990；15:417.

　　3　Weller M，Frei K，Groscurth P， et al. Anti-Fas/APO-1 antibody-mediated apoptosis of cultured human glioma cells， induction and modulation of sensitivity by cytokines. J Clin Invest 1994；94:954.

　　4　Yuan J，Shaham S，Ledoux S ，et al. The C.elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1β-converting enzyme. Cell 1993；75:641-652.

　　5　Miura M，Zhu H，Rootello R，et al. Induction of apoptosis in fibroblasts by IL-1β converting enzyme, a mammalian homolog of the C.elegans cell death gene ced-3. Cell 1993;75:653-660.

　　6　Gagliardini V, Fernandez PA, Lee R, et al. Prevention of vertebrate neuronal death by the cymA gene. Science 1994;263:826-828.

　　7　Kondo S， Barna BP， Morimura T， et al. Interleukin-1β converting enzyme mediates cisplatin-induced apoptosis in malignant glioma cells. Cancer Res 1995;55:6166-6171.