B7联合HSV-TK基因对大鼠乳腺癌的治疗作用

　　第二军医大学学报2000年第21卷第3期

　　王烈　卫立辛　王飞　曹贵松　钱其军　杨广顺　郭亚军　吴孟超

　　摘　要　目的:探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和共同刺激因子B7基因联合使用对乳腺癌动物模型的体内治疗作用。方法: 应用基因重组技术，构建分别携带HSV-TK，B7及HSV-TK/B7双基因的逆转录病毒载体。以SHZ-88细胞株建立乳腺癌动物模型，随机分为对照组、TK组、B7组及TK/B7组，每组20只。2周后于瘤体内分别注射转染有空载体及不同的重组载体的乳腺癌细胞，3 d后于腹腔内连续注射无环鸟苷(GCV) 15 d（50 mg·kg^-1.d^－1），观察肿瘤体积、荷瘤生存时间的变化和组织病理改变。结果:B7组、TK/B7组肿瘤内淋巴细胞浸润明显增多。与对照组相比, TK组、B7组肿瘤生长减缓,体积减小，荷瘤生存期延长，两组间均有显著差异(P＜0.05)，而TK/B7组尤为显著(P＜0.01)；TK组与B7组相比则无显著差异。结论: hSV-TK，B7基因联合治疗乳腺癌动物模型，能直接杀伤肿瘤,抑制肿瘤生长，延长荷瘤动物的生存期。

　　关键词：乳腺肿瘤；基因治疗；基因，单纯疱疹病毒胸苷激酶；基因，B7

　　基因治疗乳腺癌目前尚处于实验研究及早期临床阶段。应用双基因联合治疗则是近年来的研究热点之一^［1］。自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)能将无毒的药物前体无环鸟苷(GCV)代谢为毒性产物，不仅能直接杀伤宿主细胞，而且具有“旁观者效应”，杀伤作用涉及邻近细胞 。共同刺激因子B7能使肿瘤细胞产生高免疫原性，激活机体毒性T淋巴细胞产生免疫应答。本研究应用基因重组技术，构建分别携带HSV-TK，B7及HSV-TK/B7双基因的逆转录病毒载体，通过观察乳腺癌大鼠模型经不同处理后瘤体大小、质量、荷瘤生存期，研究HSV-TK和B7联合基因治疗对乳腺癌的体内抑制增强作用。

　　1　材料和方法

　　1.1　质粒及细胞　质粒GcpB7SN，pLXN，pLN-TK，pUC118均为第二军医大学国际合作肿瘤研究所钱其军博士后提供,载体均含有新霉素抗性基因(NeoR) 宿主菌DH5α及HB101钙化菌,包装细胞PA317，PE501均为国际合作肿瘤研究所保存,SHZ-88乳腺癌细胞株购自中科院上海细胞研究所。

　　1.2　试剂　各种限制性内切酶购自华美生物公司,G418，RPMI 1640购自Gibco bRL公司,仓鼠抗小鼠B7单克隆抗体(16.10A)、荧光素标记抗体为国际合作肿瘤研究所保存，PCR试剂盒购自西德Boehringer公司，GCV(Roche公司)。

　　1.3　重组mB7-1/HSV-TK逆转录病毒载体的构建　将含TK cDNA 的 pLN-TK大量扩增，以EcoRⅠ酶切质粒, 低熔点胶回收TK基因片段,然后在T4连接酶作用下，以相同克隆位点将其与线性化逆转录病毒载体GcpSN连接，获重组TK的逆转录病毒载体GcTKpSN。 mB7的逆转录病毒GcpB7SN大量扩增，以EcoRⅠ酶切低熔点胶回收线性化重组B7逆转录病毒全长，然后在T4连接酶作用下，以相同克隆位点将含TKcDNA片段与含B7线性化逆转录病毒载体连接，获重组TK/B7的逆转录病毒载体GcTKpB7SN。将重组的GcTKpSN, gcTKpB7SN, GcpB7SN分别转化HB101钙化菌，挑取20个克隆进行DNA小量制备，以酶切鉴定和PCR特异性扩增鉴定。

　　1.4　重组逆转录病毒载体的包装、收获及滴度测定　重组质粒扩增后，碱裂解法抽提，PEG8000纯化，以PE501细胞包装, 用电穿孔法进行。 收取培养液0.22μm微孔膜过滤后, 以PA317细胞包装, 在含G418培养液中筛选抗(NeoR)基因阳性细胞，计算克隆阳性细胞，测定病毒滴度。

　　1.5　重组基因对肿瘤细胞的转染及表达鉴定　以重复感染法将不同重组的抗(NeoR)基因阳性细胞分别感染SHZ-88乳腺癌细胞, 获含有重组TK/B7基因的肿瘤细胞，并以流式细胞仪、原位杂交方法分别检测乳腺癌细胞,证实有B7和TK基因表达。按文献［2,3］方法进行。

　　1.6　实验动物　SD大鼠（上海第二军医大学实验动物中心提供）80只，雌性，7 d龄，平均质量(20±2.3) g。随机分成对照组、TK组、B7组及TK/B7组，每组20只。乳腺癌SHZ-88细胞经培养扩增后，以5×10⁵细胞数分别接种乳鼠右腋皮下^［4］。2周后肿瘤平均直径达(0.9±0.3) cm, 大鼠体质量为 (80±5.30) g。对上述各组动物于瘤内中心点分别一次性等量注射空载体、GcTKpSN，GcpB7SN及GcTKpB7SN转染的的乳腺癌细胞5×10⁶个/0.2 ml。3 d后于腹腔内连续注射GCV15 d，剂量为50 mg·kg^-1.d^-1。

　　1.7　肿瘤大小和生存期的观察　在GCV开始注射后的第7，14，28，40天，分别从每组取3只大鼠，以1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔内注射麻醉, 然后应用磁共振仪(Siemens公司，Magnetom impact 1.0T)进行横断面及冠状面T1加权及T2加权扫描，测量肿瘤三维直径。肿瘤体积按公式V=Л/6×d³(d为三维直径的平均值)计算。切取并剥离肿瘤,分别称取瘤质量。之后以10%甲醛固定标本，按常规制作组织切片，行H-E染色。对剩余大鼠进行生存期观察。

　　1.8　统计学处理　以一个重复测量的双因素方差分析,Kaplam-Meier生存分析。

　　2　结　果

　　2.1　肿瘤体积和质量　TK，B7组与对照组相比，在肿瘤的体积和质量上均有差异(P＜0.05),而TK/B7组差异尤为显著(P＜0.01),并随时间的延长效果更为明显(表1)。TK组与B7组之间相比无明显差异，在治疗14 d后TK，B7组与TK/B7组之间相比差异显著(P＜0.05)。

表1　瘤内注射HSV-TK/B7基因治疗对乳腺肿瘤体积的影响

　　tab 1　The influence on tumor size by direct

　　tumor injection of HSV-TK/B7(n=20, ±s)

　　^*P＜0.05 ， ^**P＜0.01 vs control group2.2　荷瘤动物生存期　平均生存期:对照组为(55.13±4.06) d, TK组(68.88±4.09) d,B7组(68.75±5.14) d,TK/B7组(97.38±11.31) d。TK和B7组与对照组相比差异显著(P＜0.05), TK/B7组与对照组相比差异非常显著(P＜0.01,图1）。

　　2.3　肿瘤病理学的变化　镜下观察发现，对照组肿瘤细胞生长活跃并可见核分裂相，TK组见大量的肿瘤细胞凋亡组织及纤维细胞替代，B7组有大量淋巴的细胞浸润。在TK/B7组癌细胞较少，不仅有淋巴细胞浸润,而且见肿瘤细胞凋亡及大量的纤维组织替代，并随给药时间延长更为明显(图2）。

图1　瘤内注射HSV-TK/B7联合基因治疗对荷瘤大鼠的生存期影响

　　fig 1　The influence on murine survival of direct

　　tumor injection of HSV-TK/B7-○-：TK/B7 group; --：B7 group;……：TK group; --: Control group

　　3　讨　论

　　在细胞内，TK能将核苷类似物GCV磷酸化，使其进一步代谢为三磷酸GCV，后者可抑制细胞的DNA聚合酶，并作为DNA合成的终结者，从而导致细胞凋亡^［5］。如果TK基因在正常组织细胞表达，前药转换会使这些正常宿主细胞“自杀”死亡，从而产生与临床上放、化疗相似的毒副作用。逆转录病毒载体具有转染分裂旺盛细胞的特点，肿瘤组织与正常组织相比其生长更为旺盛，因此，自杀基因特异性地注射到肿瘤组织，相对增加有效转染率，使其绝大部分在肿瘤中表达，避免影响正常组织，使抗肿瘤作用主要集中在肿瘤原发或转移灶内。

图2　HSV-TK/B7基因治疗后肿瘤组织光镜下的观察

　　fig 2　Light microscopic examination of tumor cell after gene therapy of HSV-TK/B7

　　a: Tumor cell apoptosis in TK group (×400); B: Lymphocytes aggregated around tumor cell in B7 group (×600);

　　c: Tumor cell apoptosis and fibre cell form in HSV-TK/B7 group (×600)

　　B7是T淋巴细胞活化增殖需要的两个信号系统之一^［6］。虽然肿瘤细胞能表达组织相容性复合体(MHC)，但通常缺乏B7，致使肿瘤细胞为低免疫原性，于是能逃逸免疫杀伤。将B7基因导入肿瘤细胞，使其与MHC分子结合，共同刺激、诱导毒性T淋巴细胞（CTL）的产生，能激发机体T淋巴细胞对全身肿瘤的免疫反应。Hurwitz^［7］等将干扰素和B7联合应用于肿瘤治疗，取得可喜的协同治疗效果。

　　我们将转染有TK，B7基因的乳腺癌细胞，单独和联合直接行肿瘤体内注射，并系统地给予前药，观察其对肿瘤组织特异性杀伤效果及对机体免疫功能的影响。结果显示: tK，B7组的肿瘤体积均较对照组小(P＜0.05), 而TK/B7组的治疗效果较上两组更为明显(P＜0.01),其荷瘤生存期也有明显的延长。同时在病理切片上我们观察到,TK组肿瘤组织内有大量纤维细胞，肿瘤细胞出现明显的空泡变性，而很少有坏死灶，这提示TK自杀基因引致的肿瘤杀伤效应可能是引发细胞凋亡的机制。在B7，TK/B7组均可见有大量的淋巴细胞浸润,这主要是 B7基因导入肿瘤细胞与MHC分子结合，共同刺激、诱导CTL的产生，激发机体T淋巴细胞对全身肿瘤的免疫反应。在TK/B7组不仅见到肿瘤细胞的凋亡，而且有大量的淋巴细胞浸润两种状态的并存，因而其在治疗效果上较前两组更为显著。

　　通过动物实验,我们观察到HSV-TK，B7联合基因治疗乳腺癌不仅可直接诱发肿瘤细胞的“自杀”,而且能诱发机体产生抗肿瘤的免疫功能,从而具有体内抑瘤、延长荷瘤动物的生存期的作用。■

　　基金项目：国家自然科学业基金重点资助项目（39730440）；福建省自然科学基金资助项目（C9910021）；上海市卫生系统百人跨世纪学科带头人培养计划资助项目

　　作者简介：王烈（1963-），男（汉族），博士，副主任医师

　　曹贵松（第二军医大学长海医院普通外科，上海2000433)

　　王烈（南京军区福州总医院普通外科，福州 350025)

　　卫立辛（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫和基因治疗中心)

　　钱其军（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫和基因治疗中心)

　　杨广顺（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫和基因治疗中心)

　　郭亚军（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫和基因治疗中心)

　　吴孟超（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫和基因治疗中心)

　　王飞（长海医院放射科）

　　参考文献

　　［1］　Boxhorn hK, Eck SL. Gene therapy for breast cancer［J］. Hematol Oncol Clin North Am，1998,12(3):665-667.

　　［2］　Basker S, Ostrand-Rosenberg S, Nabavi N, et al. Constitutive expressing of B7 restores immunogenicity of tumor cells expressing truncated major histocompatibility complex class Ⅱ molecules［J］. Proc Natl Acad Sci uSA, 1993，90(12): 5687-5690.

　　［3］　杨木兰. 原位分子杂交技术. 见：沈关心，周　汝主编. 现代免疫学实验技术［M］.武汉：湖北科学技术出版社，1997. 454-463.

　　［4］　苏　宁，张晓明，韩月明,等.SHZ-88大鼠乳腺癌细胞系的建立及生物学特性观察［J］.癌症, 1991,10(5)：378-381.

　　［5］　Wei MX, Bougnoux P, Sacre-Salem B, et al. Suicide gene therapy of chemically induced mammary tumor in rat:efficacy and distant bystander effect［J］. cancer Res,1998,58(16):3529-3532.

　　［6］　Moro M, Gasparri AM, Pagano S, et al. Induction of thorapeutic T-cell immunity by tumor targeting with soluble recombinant B7-immunoglobul in costimulatory molecules［J］.　Cancer Res， 1999,59(11):2650-2656.

　　［7］　Hurwitz AA, Townsend SE, Yu TF, et al. Enhancement of the antitumor immune response using a combination of interferon-gama and B7 expression in an experimental mammary carcinoma［J］. Int J Cancer, 1998, 7(1):107-113.