胃癌与端粒酶活性表达及DNA倍体关系的研究

中国胃肠外科杂志 2000年第2期第3卷 论著

作者：贾汝梅　张玉印　宋伟庆　王凤安　闫庆辉　张雁

单位：050000　石家庄，河北医科大学第二医院普通外科

　　关键词： 胃癌；端粒酶；聚合酶链反应；流式细胞术

　　【摘要】　目的　揭示胃癌与端粒酶活性及DNA倍体的关系。方法　检测30例胃癌标本，同时取无瘤残端作为对照。端粒酶检测采用端粒重复扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA法)。DNA倍体的测定采用流式细胞术，一步法检测DNA含量。结果　肿瘤瘤体端粒酶阳性率83.3%(25/30)，无瘤残端端粒酶阳性率3.3%(1/30)(P＜0.05)；端粒酶阳性瘤体平均直径6.5 cm，阴性瘤体平均直径3.6 cm(P＜0.05)；端粒酶阳性肿瘤淋巴转移率53.3%(16/30)，阴性者无淋巴转移(0/5)(P＜0.05)；端粒酶阳性肿瘤中异倍体肿瘤占56.0%(14/25)，而端粒酶阴性者无异倍体出现(P＜0.05)。结论　胃癌端粒酶活性升高，端粒酶阳性肿瘤瘤体大，淋巴转移率高，且异倍体发生率高，预后差。提示端粒酶的激活与胃癌的发生发展有密切关系。

Telomerase activity and DNA ploidy in gastric cancer

JIA Rumei,ZHANG Yuyin,SONG Weiqing et al

　　Department of General Surgery,Second Hospital,Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000

　　【Abstract】　Objective　To reveal the relationship between gastric cancer and telomerase activity, DNA ploidy.Methods Thirty gastric cancer samples were detected.At the same time,30 normal adjacent mucosa samples were also detected as control.Telomerase activity was detected using telomeric repeat amplification protocal-enzyme linked immunosorbent assay(TRAP-ELISA).The DNA content was detected using flow cytometry.Results Majority of carcinomas(25/30) were telomerase positive,but the telomerase activity was observed infrequently in adjacent mucosa(1/30)(P＜0.05).The mean diameter of telomerase-positive carcinomas was 6.52cm,but the diameter of telomerase-negative carcinomas was 3.64cm(P＜0.05).The percentage of lymph node metastasis of telomerase-positive carcinomas(16/30)was higher than telomerase-negative carcinomas(0/5)(P＜0.05). The aneuploid carcinomas were 56.0% (14/25) in telomerase-positive carcinoma,but there was no aneuploid carcinoma in telomerase-negative carcinoma (P＜0.05). Conclusions Telomerase activity increases in gastric cancer.Telomerase-positive carcinomas present bigger tumor size,higher rate of lymph node metastasis, aneuploid and poorer prognosis.Telomerase activation is closely related to the carcinogenesis of gastric cancer.

　　【Key words】　Gastric cancer　Telomerase　Polymerase chain reaction　Flow cytometry

　　端粒酶是近年来生命科学和肿瘤学研究的热点之一^［1］。肿瘤细胞的重要特征之一是获得永生，其中端粒酶的活化起着关键性作用^［2］。本研究采用分子生物学与免疫学相结合的方法——端粒重复扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA法)测定端粒酶活性，用流式细胞术进行DNA倍体检测，从而阐明胃癌的发病机制。

材料与方法

　　一. 材料

　　胃癌标本30例，均来自1998年2～9月在本院接受手术治疗的患者，年龄40～71岁，男∶女为22∶8。手术后立即取材，瘤体标本取肿瘤边缘隆起的瘤体组织约0.5 cm×0.5 cm，残端取肿瘤远残端的胃黏膜0.5 cm×0.5 cm，氯化钠溶液纱布清除标本表面的血液及黏液，投入冰盒。用于端粒酶检测的标本半小时内置于-80℃冰箱保存；用于DNA倍体分析的标本用70%乙醇固定，4℃冰箱保存。所取标本在1个月内检测。

　　二. 方法

　　(一)端粒酶检测

　　采用TRAP-ELISA方法。

　　1. 提取端粒酶　取2 mm×2 mm标本加裂解液60 μL，剪碎，0 ℃静置30分钟，然后于15 000 r/min，4℃离心20分钟，取上清液备用。

　　2. PCR扩增　上清液5 μL(紫外分光光度法测定蛋白含量约50 μg)，PCR循环混合物25 μL(含引物、核苷酸和Taq酶，其中引物为biotin标记)，无菌蒸馏水20 μL进行PCR扩增。循环1为10 min，25 ℃；循环2为5 min，94 ℃；循环3～32为30 s94 ℃，30 s 50 ℃，90 s 72 ℃；循环33为10 min，72 ℃。

　　3. 变性及杂交　取PCR循环产物5 μL，加入变性液20 μL，常温放置10 min，加杂交液225 μL混匀(杂交探针为DIG标记)。

　　4. ELISA　取杂交后混合物100 μL加入MTP板(已包被biotin抗体)，常温静置2小时，然后洗板3次，加入抗DIG-POD抗体常温静置30分钟，洗板5次，加入POD底物100 μL，反应15分钟后加终止液，于30分钟内用酶标仪读取吸光度值(A)。(450 nm为检测波长，690 nm为参考波长)

　　5. 结果判定　A≤0.200为阴性，A＞0.200为阳性。

　　(二)DNA倍体检测

　　1. 细胞悬液的制备　将5 mm×5 mm标本置于120目钢网上，网搓研磨成细胞悬液，1 500 r/min常温离心5分钟弃上清液，加入0.5%胃蛋白酶2 mL，37 ℃消化30分钟，300目尼龙网过滤，1 000 r/min离心5分钟后弃上清，加入70%乙醇3 mL于4 ℃冰箱过夜。

　　2. 检测　采用Bio-Rad公司提供的DNA INDEX AND CELL CYCLE EVALUATION试剂盒，用一步法进行DNA倍体的检测，DNA指数(DI)在0.9～1.1者为二倍体，不在此范围者为异倍体。

　　(三)统计学处理

　　采用χ²检验，t检验。

结　　果

　　本研究共检测了30例胃癌标本，同时取标本远残端做正常对照，所有标本均经病理证实为癌，远残端均未受累。

　　一. 端粒酶阳性率

　　瘤体的端粒酶阳性率为83.3% (25/30)，无瘤残端阳性率为3.3% (1/30)，且为弱阳性，瘤体及残端的阳性率有显著性差异，P＜0.05。

　　二. 端粒酶活性及肿瘤临床特征的关系

　　见表1。端粒酶活性与患者的年龄、性别无关，而瘤体大小、淋巴转移与酶活性有关。

表1　端粒酶活性与肿瘤临床特征的关系

　　注：1、3项采用t检验分析；2、4项采用校正χ²检验；5、6因例数少未做统计学处理

　　三. 标本的DNA含量

　　端粒酶阳性肿瘤中异倍体14例(56.0%)，二倍体11例(44.0%)；而端粒酶阴性肿瘤5例均为二倍体。端粒酶阳性肿瘤异倍体比例明显升高(P＜0.05)。DNA倍体检测图见图1～3。

　　图1　正常人血DNA倍体图

　　DI=1.00；S=0.00%；CV=1.44

　　图2　胃癌标本DNA倍体图(二倍体)

　　DI=1.07；S=25.85%；CV=4.57

　　图3　胃癌标本DNA倍体图(异倍体)

　　整倍体峰：DI=0.98；S=0.00%；CV=11.74

　　异倍体峰：DI=1.38；S=37.68%；CV=7.62

讨　　论

　　端粒酶是蛋白质及RNA组成的核糖核蛋白，其主要作用是维持端粒的长度。正常情况下，体细胞端粒酶处于失活状态。随着有丝分裂次数的增加，端粒逐渐缩短，当其缩短到一定程度，细胞停止分裂进入永生化Ⅰ期，即M1期。此期大部分细胞在P53基因调控下将衰老死亡，仅有少部分细胞通过病毒癌基因的整合或P53、RB基因等抑癌基因的突变使细胞逃脱死亡，再继续分裂50次左右，端粒长度缩短到危机点，细胞进入永生化Ⅱ期，即M2期。绝大部分细胞因为端粒极度缩短不能维持其功能而死亡，仅有少部分细胞通过某种机制激活端粒酶，使端粒长度得以维持，因而成为永生化细胞。这便是肿瘤发生的端粒-端粒酶学说^［3］。

　　本研究中，我们采用的端粒酶检测方法为TRAP-ELISA法，是分子生物学与免疫学相结合的方法。该方法与TRAP法不同的是用ELISA法对PCR扩增产物进行检测，而并非引入放射性物质，整个过程仅需6～8小时就可完成，灵敏度与TRAP法相似，具有简单、迅速、可靠、敏感、无放射性污染的特点，是一种很好的检测端粒酶活性的方法。

　　Hiyama等^［4］检测66例胃癌及残端标本的端粒酶活性，早期胃癌的阳性率82.3% (14/17)，中晚期阳性率为85.7% (42/49)，残端阳性率为6.1% (4/66)。表明在胃癌中端粒酶活性升高。本研究中胃癌端粒酶阳性率为83.3% (25/30)，非瘤残端阳性率为3.3% (1/30)，说明端粒酶活性升高在胃癌中是一种普遍现象，我们认为端粒酶可以作为胃肠道肿瘤诊断的有力标志物。

　　我们的结果中有5例肿瘤端粒酶阴性，其原因为：(1)端粒酶的激活是细胞多次分裂经历M1期、M2期后发生的事件，而有些肿瘤细胞处于前M2期尚未激活端粒酶，所以这些肿瘤端粒酶阴性；(2)肿瘤细胞永生性的获得除端粒酶途径外尚有其它旁路途径。在这种情况下，端粒酶虽未被激活，细胞仍获得了永生性。同时我们检测到，1例胃癌非瘤残端为端粒酶阳性，其病理检测是黏膜重度炎症伴肠上皮化生(Ⅲ级)。该例残端酶阳性的原因为：(1)残端组织重度炎症，大量淋巴细胞浸润，而淋巴细胞有微弱的端粒酶活性^［5］，所以炎症反应极重的组织端粒酶可能会呈弱阳性；(2)残端组织含微转移灶所致，病理仅能通过光镜检测1个平面有无癌转移，端粒酶检测则是测定立体团块细胞的酶活性，比光镜更全面，更易发现肿瘤微转移灶；(3)癌前病变也可导致端粒酶阳性表达^［6］。该残端阳性的病例为重度肠上皮化生，能导致端粒酶阳性表达。

　　端粒酶活性及肿瘤临床特征关系的研究结果表明，端粒酶的活性与瘤体的大小及淋巴转移率有明显关系，同Hiyama等^［5］的检测结果一致。随着肿瘤细胞分裂次数的增多，瘤体的增大，肿瘤的淋巴转移机会增加，瘤体内的前M2期细胞也会经历M2期激活端粒酶成为永生化细胞。因此瘤体大的肿瘤端粒酶活性往往要高于瘤体小的肿瘤，端粒酶活性与肿瘤的大小及淋巴转移有关，反映肿瘤的恶性进程。

　　端粒酶活性与细胞DNA倍体也有一定关系。本试验中端粒酶阳性肿瘤异倍体占56.0% (14/25例)，阴性者均为二倍体，与日本学者Okusa等^［7］的研究结果相似。在细胞分裂过程中，端粒将缩短，端粒的主要功能之一是维持染色体的稳定性，防止染色体相互融合及降解。当端粒缩短到一定程度而不能维持其功能，染色体就会发生畸变，形成双着丝粒染色体、环行染色体及染色体缺失等，此时细胞便表现为异倍体。同时这些极短的端粒也会激活端粒酶，所以端粒酶阳性的细胞异倍体比例较高。异倍体肿瘤染色体发生畸变，恶性程度高，预后差。因而端粒酶活性可以反应肿瘤的恶性潜能，与患者预后相关。

　　我们认为端粒酶激活在恶性肿瘤的进程中是重要因素，随着端粒酶研究的进一步深入，端粒酶检测将为临床肿瘤诊断、治疗及预后判断提供有用信息。

参考文献

　　1，Michelle S, Rliyu MS.Telomeres telomerase and immortality.J Natl Cancer 1995;87:884-894.

　　2，Kim NW,Piadtyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cell and cancer.Science 1994;266;2011-2015.

　　3，Hiyama E,Yokyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer.Cancer Res 1995；55:3258-3262.

　　4，Hiyama K,Hiarai YK,Kyoizumi SS,et al.Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cell.J Immunol 1995,155:3711.

　　5，Yashima K,Litzky LA,Kaiser L,et al.Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinoma.Cancer Res 1997；350:2373.

　　6，Okusa Y,shinomiya N,Ichikura T,et al.correlation between telomerase activity and DNA ploidy in gastric cancer.Oncology 1998；55:258.

收稿：1999-07-21

　　修回：2000-01-04