腹膜乳斑与胃癌细胞在腹膜播散中的关系
中国胃肠外科杂志 2000年第3期第3卷 论著
作者：安伟德 胡祥 梁品 吴昊 沈忠义
单位：116011 大连医科大学第一临床学院普外科
关键词： 胃肿瘤；肿瘤转移；腹膜；乳斑
【摘要】目的研究腹膜乳斑与胃癌细胞在腹膜播散中的关系。方法30只经环孢素A处理的SD大鼠分成3组，分别向大鼠腹腔内接种经溴脱氧尿甙(BrdU)标记的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞，数量分别为105、106和107。应用免疫组织化学染色，观察癌细胞的分布。计数网膜乳斑或非乳斑区标记细胞的数量，确定癌细胞的分布。结果在乳斑或非乳斑区平均标记细胞数的比率分别是163∶1(105)、280∶1(106)和697∶1(107)。标记细胞数在乳斑或非乳斑区之间的差异有显著性意义(P＜001)。结论标记细胞选择性地侵入网膜乳斑，表明在胃癌腹膜播散的早期，癌细胞具有特异地侵入腹膜乳斑的特性。
The relationship between peritoneal milky spots and peritoneal dissemination of gastric carcinoma
AN Weide,HU Xiang,LIANG Pin,et al
(Department of Surgery,First Affiliated Hospital,Dalian University of Medical Sciences,Dalian 116011,China)
【 Abstract】 Objective To investigate the relationship between peritoneal milky spots and peritoneal dissemination of gastric carcinoma. Methods Thirty SD rats treated with cyclosporin A were divided into 3 groups and inoculated introperitoneally with human gastric cancer sy86B cells labeled with bromodeoxyuridine(BrdU)at 105、 106 and 107 cells per rat.The distribution of the labeled cells in the greater omentum,taken from the rats using an anti BrdU antibody,was observed with immunohistochemical assay.The number of the BrdU labeled cell per unit area at each milky spot and non milky spot in the omentum was counted.Results The ratios of the mean labeled cell numbers in the milky spot sites to that in the non milky spot sites were 163∶ 1(105)， 280∶ 1(106) and 697∶ 1(107)respectively.There were statistically significant differences of the numbers of BrdU labeled cell· mm－ 2 between milky spot sites and non milky spot sites.Conclusion Labeled cancer cells spreading in the peritoneal cavity infiltrate selectively milky spots in the early stage of peritoneal dissemination of gastric carcinoma.
【Key words】 Gastric neoplasm; Neoplasm metastasis; Peritoneum; Milky spots
乳斑(milkyspots)是由巨噬细胞聚集围绕着血管网构成的，在腹腔内主要集中在大网膜上。过去人们认为癌腹膜播散是脱落的癌细胞通过重力作用撒落、黏附在低位脏器浆膜面后形成转移病灶。近年来的研究表明在癌细胞腹膜播散过程中乳斑起着重要的作用[1]。我们以网膜作为研究材料，通过向大鼠腹腔内接种经溴脱氧尿甙(BrdU)标记的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞株[2]，追踪观查其分布情况以及在乳斑中的聚集状态，研究网膜乳斑与胃癌细胞腹膜播散的关系，以期证实腹膜乳斑在胃癌细胞腹膜播散中的特殊位点的作用。
材料与方法
一、实验动物及移植瘤准备
健康雄性SD大鼠，鼠龄3～4周，重量70～80g，由大连医科大学实验动物部标准化室提供。移植前使用环孢素A(cyclosporinA，德国产)60mg/kg，皮下注射，每日1次,共6次，抑制大鼠细胞免疫功能[3]；环磷酰胺(0.02mg/kg)处理大鼠腹腔。腹水传代细胞株是由中国医科大学提供的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞株，该腹水型细胞株自携带瘤的裸鼠腹腔内提取腹水型细胞株后，洗涤离心除去上清细胞碎片和红细胞。取细胞加入1640完全培养液(RPMI1640，美国Gibco，含20％灭活小牛血清)，细胞浓度调至106/ml备用。
二、5溴脱氧尿甙bromodeoxyuridine(BrdU)作S期细胞标记
在处理后的细胞悬浮液中加入BrdU(WakoChemicalIndustries,Japan)，分别为0.5μg/ml、5μg/ml和50μg/ml作S期细胞标记[4]，放置在37℃、5％CO2孵箱中孵育，每种浓度分别孵育12、24、48和72h，然后从孵育不同时间的4瓶单细胞悬液中各自提取5ml，以1000r/min离心5min后除去上清，沉淀中加入PBS冲洗，离心和冲洗重复3次，以除去游离的BrdU。然后作细胞活性及BrdU的细胞标记指数的测定。
三、标记后细胞活性及BrdU标记指数的测定
用0.4％台酚蓝溶液0.1ml对1ml不同浓度(0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml，不含BrdU)及经不同时间孵育的(12、24、48和72h)细胞悬浮液染色，在光学显微镜下用台酚蓝排染法观察计数200个肿瘤细胞中蓝染的细胞百分比——死亡率，根据3次实验结果求细胞存活率的平均值，通过免疫细胞化学方法(ABC法)测定细胞标记指数。取0.1ml标记孵育后的细胞悬浮液涂铺在经多聚赖氨酸处理的玻片上，甲醇∶醋酸(3∶1)固定，空气凉干，0.3％H2O2甲醇灭活内源性酶；5％正常兔血清封闭；甲酰胺100℃5min变性核酸；应用小鼠抗BrdU单克隆抗体(1∶100)PBS中稀释，常温下作用1h或4℃过夜。再用生物素化兔抗小鼠IgG(1∶100)37℃60min，加ABC(1∶100)，37℃45min，DAB显色，甲基绿衬染。阴性对照为未加BrdU的Sy86B细胞，一抗用PBS代替。光镜下观察细胞着色情况。乳斑内的巨噬细胞为墨绿色，而标记上的细胞其细胞核将有棕褐色着色，此为阳性，用着色细胞占记数细胞中的百分数来表示标记指数。应用流式细胞术(flowcytometry,FCM)对标记孵育后(以5μg/ml加入BrdU孵育24h)的细胞悬浮液106/ml采用CoulterEpicsXL流式细胞仪进一步测定。
四、实验动物分组与网膜免疫组织化学(组化)染色 将单细胞悬液加入BrdU5μg/ml标记孵育24h后，对经处理的SD大鼠行腹腔内接种。SD大鼠分为3组，每组10只，3组腹腔内注入的标记细胞数量分别为105/ml、106/ml和107/ml。腹腔注入BrdU标记癌细胞后的SD大鼠饲养24h，处死后将大网膜切下展平、固定，在4％PBS福尔马林液中过夜。网膜用1％H2O2甲醇，灭活内源性酶；5％正常兔血清封闭；使用1∶100稀释的小鼠抗BrdU单抗(Sigma)4℃、24h对大鼠网膜做免疫组化染色，再用生物素化兔抗小鼠IgG(1∶100)二抗室温孵育2h，加ABC(1∶100)37℃3h，DAB显色5min。标本用甲基绿做复染，脱水，放置在立体显微镜下观察BrdU标记癌细胞的分布。
五、标记细胞的计数分析
应用计算机扫描图像分析仪(LeicaQ500MC)对乳斑或非乳斑区标记细胞进行计数分析。
六、统计学处理
应用配对t检验。
结果
一、BrdU的标记率及细胞活性
用抗BrdU单抗行免疫细胞化学染色(ABC法)，检测Sy86B人胃癌细胞S期的BrdU细胞标记率如图1，用台酚蓝排除法测定细胞活性如图2。我们发现单细胞悬液以5μg/ml加入BrdU孵育24h是最理想，其细胞标记率为(74.8±1.6)％，细胞活性率为(91.8±1.2)％，此时流式细胞仪检测图像如图3。
二、乳斑和非乳斑区标记细胞数量
3组(105/ml、106/ml、107/ml组)BrdU标记的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞在乳斑区及非乳斑区的结果见表1。在乳斑或非乳斑区平均标记细胞数的比率分别是163∶1、280∶1和697∶1。应用抗BrdU抗体对网膜行免疫组化方法，在显微镜下所观察到经BrdU标记的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞选择性地侵入网膜乳斑，见图4。
图1各种条件下Sy86B人胃癌细胞BrdU的标记指数
图2各种BrdU浓度标记下细胞活性
表1乳斑和非乳斑区BrdU标记细胞数量
| 接种细胞数
(细胞) |
乳斑区标记细胞数＊
( ±s/mm2) |
非乳斑区标记细胞数＃(±s/mm2) |
比率° |
P值 |
| 105 |
14.58±6.83 |
0.09±0.04 |
163∶1 |
＜0.01 |
| 106 |
111.16±35.24 |
0.40±0.10 |
280∶1 |
＜0.01 |
| 107 |
492.66±163.84 |
0.71±0.32 |
697∶1 |
＜0.01 a |
注：＊乳斑区和非乳斑区每平方毫米侵入标记细胞的数量，是不同数量BrdU标记细胞接种10只大鼠，取10只大鼠网膜标本所计算得出的数量。
＃其比率是乳斑区和非乳斑区各自标记细胞平均数计算所得出。
在所有观察标本中，乳斑和非乳斑区每mm2BrdU标记细胞数经配对t检验，两区间差异有非常显著性意义(P＜0.01)。随着接种标记细胞数的增加比率增加。
同样条件下，经标记细胞接种处理后的另一组SD大鼠，喂养3周后从取材网膜观察发现，所形成的癌肿转移灶主要在网膜乳斑区，而网膜非乳斑区基本上看不到癌浸润。
讨论
胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，而腹膜转移是其重要的转移途径，也一直是胃癌研究的焦点。乳斑是由巨噬细胞聚集为主伴随少量淋巴细胞、肥大细胞围绕着血管网构成的。乳斑具有微小棉毛状的外观，较大的乳斑呈现椭圆型，直径为(756±22)μm，乳斑主要集中在大网膜上，在肠系膜上和盆腔腹膜分布相对较少，癌腹膜播散过程中乳斑在转移灶形成中具有特殊的作用[5]。为了明确乳斑这一特殊的作用，我们选用网膜作为研究材料，应用BrdU对Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞进行标记，使用免疫细胞化学染色技术，检测BrdU的S期细胞标记率为(74.8±1.6)％；用台酚蓝排除法测定细胞活性，细胞活性率为(91.8±1.2)％。说明此项标记技术对Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞标记率是较高的，而且不影响细胞活性。
本研究结果显示，大鼠腹腔内接种BrdU标记的Sy86B裸鼠可移植性人胃癌细胞株，其主要集中于网膜乳斑中，乳斑内BrdU标记细胞远比非乳斑区内多，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。而且改变接种细胞浓度仍显示同样的倾向。抗BrdU单克隆抗体有较高的特异性，应用抗BrdU抗体对网膜行免疫组化方法检测，能较好地反映胃癌细胞在网膜上的分布情况。利用计算机图像扫描仪对乳斑或非乳斑区标记细胞进行记数分析，能较好地反映标记细胞分布的数量关系，使观察网膜播散特性成为可能。本研究结果提示，癌细胞在腹腔内接种，其分布主要集中在乳斑中，有分布、播散的区域性，也证实了腹膜乳斑在胃癌细胞腹膜播散中有早期特异性选择点的作用。腹膜乳斑作为胃癌腹膜播散的早期特异性选择点这一事实的揭示，为癌腹膜转移途径的模式及早期诊断提供了一定的理论依据。
图3BrdU浓度为5μg/ml孵育24h及对照组的检测
图4标记癌细胞阳性染色(×100)
基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目(9810500106)
参 考 文 献
1,Krist LF,Kerremans M,Broekhuis Fluitsma DM,et al.Milky spots in the greater omentum are predominant sites of local tumour cell proliferation and accumulation in the peritoneal cavity.Cancer Immunol Immunother,1998,47:205 212.
2,Hong Li,Yichang Z,Wei G,et al.Invasion and metastasis of Sy86B human gastric carcinoma cells in nude mice.Jpn J Cancer Res,1988,79:750.
3,Yamada H.Histological take rates of fresh human tumors in the subrenal capsular space of cyclosporin A treated mice.Jpn J Cancer Chemother,1986,16:2613.
4,John SM,Sherri LK,Jackie MH,et al.Bromodeoxyuridine labeling for S phase measurement in breast carcinoma. Cancer,1993,71:3531.
5,安伟德，胡祥.网膜乳斑在胃癌腹膜播散过程中作用的研究进展.国外医学肿瘤学分册，1999，26：257258.
(收稿日期：2000-06-20)
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