胃癌高发区食品中N-甲基亚硝基脲的分离鉴定

北京医科大学学报 1999年第4期第31卷 论著

作者：邓大君　杨树民　李　彤　辛慧君

单位：邓大君　李　彤　辛慧君　北京医科大学临床肿瘤学院(北京市肿瘤防治研究所)，北京　100034；杨树民　国家兴奋剂检测中心

关键词：胃肿瘤；鱼；食品；N-甲基亚硝基脉☆；亚硝基脲化合物；分离和提纯

　　摘　要　目的：从亚硝化食品中分离鉴定N-亚硝酰胺。方法：用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）-光水解热裂解-热能分析仪联机技术，从胃癌高发区食品鱼露亚硝化产物中直接分离、测定和制备热不稳定性N-亚硝酰胺色谱组份；利用HPLC-电喷雾离子化-质谱计和HPLC-紫外光谱仪联机技术，对该色谱峰的制备组份进行结构确证。结果：从亚硝化鱼露中直接分离到一种热不稳定性N-亚硝基化合物，其色谱保留时间与N-甲基亚硝基脲（N-nitrosomethylurea, NMU）相同；进行结构确证研究发现，该色谱峰的质谱特征峰(m/z 64、102、145)及紫外吸收光谱(λ_max=230 nm)与NMU标准品相同。结论：实验结果充分说明该色谱峰含NMU，首次直接证明了亚硝化食品中存在NMU。

　　 中国图书资料分类法分类号　R735.2

Separation and identification of N-(nitrosomethyl)urea

　　in fish sauce from high risk area of stomach cancer

DENG Da-Jun^＃, YANG Shu-Min, LI Tong, XIN Hui-Jun

　　(＃School of Oncology, Beijing Medical University(BICR)， Beijing　100034)

　　ABSTRACT　Objective:To identify chemical carcinogens in nitrosated food.Methods: Fish sauce samples from a high risk area for stomach cancer were nitrosated under simulated human stomach conditions. The chromatographic components of thermal-unstable N-nitrosamides were separated, detected, and prepared directly with high performance liquid chromatography (HPLC)-photohydrolysis-pyrolysis-thermal energy analyzer. The chemical structure of one of the components was compared with authentic N-(nitrosomethyl)urea (NMU) by HPLC-electronic spray ionization-mass spectrometer and HPLC-UV diode array detector.Results: One thermal-unstable N-nitroso compound was separated from nitrosated fish sauce sample. Its retention time was the same as that of the authentic NMU. The corresponding chromatic fraction of the chemical showed also the same mass spectrum (m/z values 64, 102, 145) and spectrum of ultraviolet-absorbency (λ_max=230 nm) as those of NMU.Conclusion: These results proved that the component was NMU. This is the first report that there is NMU in nitrosated food.

　　MeSH　Gastric neoplasma　　Fish　　Food　　N-(nitrosomethyl)urea^☆　　Nitrosourea compounds/isol

　　胃癌死亡率仍居我国恶性肿瘤之首，N-亚硝酰胺类化合物(N-nitrosamides, NAD)可能是人胃癌发生的主要启动因素^［1，2］。由于NAD化学稳定性差，既往长期缺乏有效检测手段，迄今没有诸如人体内外环境中天然性NAD的种类、化学结构、分布和代谢以及危害性等资料，使得人胃癌NAD病因理论缺乏一块重要基石。近年高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)与NAD光水解/热裂解器(photolysis and pyrolysis, PHPS)-热能分析仪(thermal energy analyzer, TEA)或类似联机检测方法的建立^［3］，使得分离鉴定人体内外环境中亚硝酰胺成为可能。胃癌高发区居民食用的鱼露在类似人胃内条件下亚硝化后能诱发大鼠胃腺癌^［4］，本文利用HPLC-PHPS-TEA等多种分离鉴定手段，首次直接证明亚硝化鱼露样品(N-nitrosated fish sauce, NFS)中存在N-甲基亚硝基脲(N-nitrosomethylurea, NMU)。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂和样品

　　NMU标准品(Sigma)、乙腈(acetonitrile, BDH)、国产丙酮(acetone, AR)和二氯甲烷(dichloromethane, AR)经重蒸纯化后使用。鱼露样品采自胃癌高发区福建长乐市古槐乡。

　　1.2　样品亚硝化、纯化、浓缩

　　参考文献［4］方法进行。10 ml鱼露在37　℃水浴和pH2.0条件下亚硒酸钠（5 mmol·L^－1）孵育1 h，沉淀去蛋白，丙酮/二氯甲烷萃取，旋转蒸发至干,供次日HPLC-PHPS-TEA分离测定或制备分离使用。加入样品中的NMU标准品的绝对回收率约为50％。

　　1.3　样品NAD色谱分离测定

　　用10 mmol·L^－1三氟乙酸2　ml溶解10　ml NFS的萃取浓缩物，按文献［3］方法，以Hamilton PRP-1(10 μm, 150 mm, 4.1 mm内径)反相HPLC分析柱、10 mmol·L^－1三氟乙酸和体积分数为0～22%的乙腈流动相，流速1.0 ml·min^－1，对鱼露样品纯化浓缩物中的NAD进行HPLC (Waters 510)-PHPS-TEA (510, Thermal Electr. Co., USA)法梯度洗脱分离测定。对NFS萃取物进行柱后光水解和不光水解比较测定，以确定色谱峰的热不稳定性。

　　1.4　NAD色谱组份制备、浓缩

　　将60 ml NFS的浓缩物溶解于1.2 ml的10 mmol·L^－1三氟乙酸流动相中，按文献［3］方法建立样品NAD的Hamilton PRP-1半制备柱(10 μm, 305 mm, 7.0 mm内径)分离方法，进样量改为120 μl、流速改为2.5 ml·min^－1，将1/3的流动相从柱后引入PHPS-TEA检测器，测定待制备色谱峰的保留时间，收集保留时间前、后1 min之间的流动相，对收集组份进行再次萃取和浓缩（至1 ml），－20　℃保存，供次日进行波谱测定使用。

　　1.5　HPLC-质谱(mass spectrum, MS)测定

　　首先建立NMU标准品的HPLC(惠普1090M)-电喷雾离子化接口(electrospray ionizing, ESI)-MS(惠普5989A四极质谱仪)检测方法。色谱条件：进样量2 μl， Zorbax C18分析柱(150 mm，　2.1 mm内径)，纯乙腈(光谱纯)流动相(0.3 ml·min^－1)；雾化和质谱工作条件：喷雾气压(氮气)550　kPa、干燥气体(氮气)10 L·min^－1、干燥气体温度100　℃、阳离子采集模式、CID 150　V、扫描范围50～200　m/z（误差±0.1）。然后将60 ml NFS色谱制备组份浓缩至干，再用0.6 ml流动相溶解，在上述条件下分离测定样品的102　m/z离子色谱和保留时间及其质谱。NMU的检出限(以145 m/z单离子采集方式计算)为100 ng。

　　1.6　液相色谱－紫外光谱测定

　　以添加NMU标准品的未亚硝化鱼露色谱制备组份为对照，水/乙腈(体积比1∶1)为流动相(0.4 ml·min^－1)，用Zorbax C18分析柱对NFS色谱制备组份的浓缩物进行HPLC (HP1090M)再分离（进样量1 μl），以二极管阵列紫外检测器测定色谱图和紫外吸收光谱。

　　2　结果

　　2.1　NFS中NAD的HPLC分离测定和制备

　　当用PRP-1分析柱对NFS纯化萃取物中的NAD，进行HPLC-PHPS-TEA法分离测定时，在与NMU标准品保留时间相同处(12 min)，可见一明显的色谱峰，含量为19.8 μmol·L^－1(图1-a、b)；未经亚硝化的鱼露样品中检测不到此峰。在不进行柱后光水解的条件下，该色谱组份（下称可疑NMU）与NMU标准品一样不能检出(图1-c)。

　　在用PRP-1半制备柱进行HPLPC-HPS-TEA检测时，发现NFS中可疑NMU峰的保留时间变为13.5 min。由于PHPS-TEA检测器会完全破坏待测化合物，必需直接从色谱柱后收集含可疑NMU峰的流动相。在PHPS-TEA检测器内色谱组份的保留时间为1.5 min，故在柱后收集从保留时间11 min到13 min的流动相。

　　2.2　NFS可疑NMU峰制备组份与NMU标准品的质谱比较

　　以Zorbax C18分析柱，纯乙腈为流动相，进行HPLC-ESI-MS分离检测，发现在145分子离子色谱图中NFS可疑NMU制备物和NMU标准品的保留时间相似，分别为1.89 min和1.86 min；在50～200 m/z的扫描范围内，NFS可疑NMU制备物和NMU色谱峰的质谱特征峰均为64、102、145 m/z（图2）。

a， from NMU (40 ng)-spiked nitrosated fish sauce with photohydrolysis; b， from nitrosated fish sauce with photohydrolysis; c， nitrosated fish sauce without photohydrolysis.

　　图1　亚硝化鱼露萃取物PRP-1分析柱的

　　HPLC-PHPS-TEA分离测定色谱图

　　Figure 1　Chromatograms obtained by HPLC-PHPS-TEA

　　from nitrosated fish sauce

　　2.3　NFS可疑NMU组份与MNU标准品的紫外吸收光谱比较（图3、4）

　　以Zorbax C18为分析柱，体积分数为50%的乙腈为流动相，对NFS可疑NMU制备物进行HPLC再分离和二极管阵列紫外检测器检测，发现该可疑NMU制备物可分为2个峰，均为溶剂峰的拖尾峰，保留时间分别为1.55 min和1.69 min，前者的最大吸收峰（λ_max）为230 nm，后者为199 nm。添加NMU标准品的未亚硝化鱼露样品制备物只有一个与溶剂峰完全分离的色谱峰，保留时间为1.55 min，其λ_max也是230 nm。2个样品的1.55 min峰的紫外吸收光谱在210～400　nm之间相同。处于溶剂峰拖尾上的NFS可疑NMU制备物的1.55 min色谱峰在190～210　nm之间出现了一个小吸收峰，标准品对照中无此吸收峰。

　　3　讨论

　　NAD的前体物广泛存在于人体内、外环境中，在类似人胃内酸性条件下能化学合成NAD。NMU、MNNG和ENNG等NAD人工合成品是强烈的实验动物胃癌诱导剂，对所有的实验动物暴露部位直接致癌。因此，NAD被认为是高度可疑的人胃癌启动因素^［1，2］。有报道胃癌高发区居民空腹胃液中NAD总量暴露水平高于低发区，癌前病变患者高于正常人^［5，6］，为胃癌NAD病因假说提供了直接的流行病学证据。然而，除去人类存在医源性暴露人工合成的亚硝基脲类化疗药外，脲链霉素是目前唯一已知的天然性NAD——由一种罕见的无色脲链霉菌突变株合成的亚硝基脲类化合物。

　　3.1　食物中NAD的研究

　　Piacek-Llanes等^［7］报道，在类似人胃内条件下一种豆类(fava beans)能亚硝化合成一种直接致突变物，可能属于N-亚硝基脲，但是没有提供结构鉴定证据。Mirvish等(1978, 1982)报道一种日本干咸鱼在经过亚硝化和去亚硝化处理后甲基脲的质量达每千克重量16～31 mg，尽管这种鱼本身不含甲基脲，甲基脲能由肌酐转化形成，他们也没有直接证明这种亚硝化咸鱼中存在NMU。鱼露是我国胃癌死亡率最高的福建长乐市居民的传统调味品，人群鱼露的摄入水平与胃癌流行呈正相关。它由小海鱼与食盐长期发酵而成，富含肌酸、肌酐等可亚硝化胺类，在类似人胃内条件下亚硝化时能够形成N－亚硝基化合物(N－nitroso compounds, NOC)^［8］，并且具有致突变和致大鼠腺胃腺癌作用^［4］。本文首先利用HPLC-PHPS-TEA技术，对NFS中的NOC进行分离测定，发现其中存在一种保留时间与NMU标准品相同的成份。根据热不稳定性NOC（以NAD为主）在TEA系统中不能直接检出，测定色谱峰在PHPS-TEA和单纯TEA两种检测条件下的响应差别能确定色谱峰是否属于热不稳定性NOC的原理^［2，3］，对NFS的NOC色谱峰进行这种响应差别测定表明，该成份同NMU等其它NAD一样属于热不稳定性NOC。这些现象强烈提示它就是NMU。

　　3.2　鱼露NMU的结构确证及质谱解析

　　近年HPLC与MS联机系统中SPI接口技术的成功运用，使得利用MS技术研究热不稳定性化合物的工作有了可行性。作者利用HPLC-ESI-MS技术，首先建立了NMU标准品的质谱测定方法，发现在以纯乙腈为流动相、阳离子采集模式、低干燥气体温度(100　℃)的特殊条件下，能够灵敏地测定出NMU标准品的质谱图，在保留时间1.86 min处色谱峰的质谱特征峰为64、102、145（m/z）。在该条件下对NFS可疑NMU色谱制备组份进行质谱测定，发现它在保留时间1.89 min处的质谱特征峰与NMU标准品相同。

图2　NFS可疑NMU色谱制备组份(A)和

　　NMU标准品(B)的C18柱色谱峰（1.89和.86 min）质谱图

　　Figure 2　MS of the chromatographic peak at tR 1.89

　　and 1.86 min obtained by HPLC-ESI-MS from

　　the preparative fraction of the nitrosated fish

　　sauce (A) and the authentic NMU (B)

　　 图3　含NMU标准品的未亚硝化鱼露色谱制备组份的

　　C18柱再分离色谱(B)和紫外吸收光谱(A)

　　Figure 3　Chromatogram (A) and spectrum of UV-absorbance (B)

　　of the component from authentic NMU-spiked

　　fish sauce without nitrosation　　145离子峰可能是质子化的流动相乙腈分子（1+41=42）与NMU分子［H₂N—CO—N(CH₃)—NO；相对分子质量为103］形成的复合分子离子峰；64离子峰可能是该复合分子进一步电离脱氨［NH₃，相对分子质量为17］形成的2价128离子碎片峰的表现；NMU分子在受热时很容易发生分子重排放出氮气［N₂］，同时形成氨基甲酸甲酯分子［H₂N—COOCH₃］，进一步电离形成氨基甲酸根［H₂N—COO^－；相对分子质量为60］，再与质子化的乙腈分子结合，形成102复合分子离子峰。当流动相中含水或以甲醇等为流动相时则难以检出NMU的质谱峰，在雾化温度升高时检出的灵敏度迅速下降(结果中未提及)，这与NMU为热不稳定性化合物的特点相符合。乙腈分子由于能与NMU形成复合分子而具有稳定NMU的作用。

图4　NFS可疑NMU色谱制备组份的C18柱

　　再分离色谱(B)和紫外吸收光谱(A)

　　Figure 4　Chromatogram (A) and spectrum of UV-absorbance (B)

　　of the possible NMU component from nitrosated fish sauce

　　用C18柱对添加了NMU标准品的未亚硝化鱼露对照样品的制备组份和NFS中的可疑NMU制备组份进行HPLC再分离，发现两种样品的制备组份都存在保留时间为1.55 min的色谱峰。比较二极管阵列紫外检测器测定的吸收光谱，发现两者的紫外吸收光谱在210～400 nm之间相同，在体积分数为50％的乙腈流动相中的λ_max值均为230 nm，与文献报道NMU在水溶液中的λ_max（231nm）相似^［9］。NFS可疑NMU色谱峰在190～210　nm之间出现的紫外吸收峰，可能是该峰处于溶剂峰的拖尾上，为溶剂峰的干扰所致。

　　根据两者在多种色谱分离条件下保留时间相同、都是热不稳定性NOC、质谱和紫外吸收光谱基本相同这些结果，作者认为已经能够充分说明NFS中的可疑NMU组份含有NMU，首次直接证实了亚硝化食品中存在NMU。最近我们又发现摄入鱼露的实验猪和人体志愿者胃液中也存在亚硝化合成的NMU^［10］，为胃癌NAD病因理论提供了重要证据。

　　(北京市肿瘤防治研究所的王儒明、谷连坤、周静等参与了本文的实验技术工作，将此致谢)

　　国家自然科学基金(39470780)和北京市科技新星计划(854871900)资助项目；

　　☆　自由词。

　　参考文献

　　1　Mirvish SS. The etiology of gastric cancer: intragastric N-nitrosamide formation and other theories. J Natl Cancer Inst, 1983,71:630-647

　　2　Deng DJ, Pan KF, Li T, et al. Recent advances on N-nitrosamides and causes of stomach cancer in China. In: 1st Intl Gastric Cancer Congress, Nishi M, Sugano H, Takahashi T, Eds. Bologna (Italy)： Monduzzi Editore SpA, 1995,501-505

　　3　李　彤，邓大君.灵敏特异的分离和测定N-亚硝酰胺方法的首次建立.中华肿瘤杂志， 1995，17(S):70-72

　　4　Deng DJ， Zhang RF， Chen Y， et al. Mutagenicity and carcinogenicity of fish sauce from a county with the high risk for gastric cancer in China. Chinese J Cancer Res, 1991,3:18-23

　　5　邓大君，昌云生，李吉友，等.胃癌高低发区居民空腹胃液中N-亚硝酰胺总含量的比较.中华肿瘤杂志， 1997，19:96-99

　　6　Zhang RF, Deng DJ, Chen Y, et al. Role of nitrosamides in the high risk for gastric cancer in China. IARC Sci Publ, 1991,105:152-157

　　7　Piacek-Llanes BG， Tannenbaum SR. Formation of an activated N-nitroso compound in nitrite-treated fava beans (vicia faba). Carcinogenesis, 1982,3:1379-1384

　　8　张汝黻，邓大君，陈　跃，等.胃癌高发区鱼露中N-亚硝基化合物前体的分析.癌症, 1993;12(5):395-398

　　9　IARC Working Group. IARC some N-Nitroso compounds. monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, Lyon: IARC, 1978,17:227-229

　　10　Deng DJ, Xin HJ. Formation of N-(nitrosomethyl)urea in stomachs of experimental pigs and human volunters taken fish sauce in vivo. In: Kim J, Min J, Mok Y， Eds. 3rd intl gastric cancer congress. Bologna (Italy)： Monduzzi Editore SpA, 1999.215-219

（1998-07-13收稿)