CD44V6的表达对大肠癌细胞骨架的影响

中华病理学杂志 1998年第4期第27卷 *论著*

作者：李祖国　丁彦青　邓永键　朱梅刚

单位：*论著*

关键词：结肠肿瘤；受体；淋巴细胞归巢；肿瘤转移；肌动蛋白类；肿瘤细胞；培养的

　　【摘要】　目的　研究CD44V6在大肠癌细胞系HT29、LoVo细胞中的表达及其对细胞骨架的影响，探讨CD44V6影响肿瘤转移的作用机理。方法　应用原位分子杂交、免疫组化、免疫荧光定量分析的方法研究CD44V6在人大肠癌细胞中的表达，应用免疫荧光及共聚焦三维图像重构分析的方法,研究CD44V6对大肠癌细胞的细胞骨架的影响。结果　CD44V6在HT29、LoVo细胞中均有表达，不管在mRNA水平还是在蛋白质水平,高转移能力的LoVo细胞表达CD44V6均高于低转移能力的HT29细胞。将HT29、LoVo细胞用CD44V6单抗封闭则发现CD44V6能使HT29、LoVo细胞的细胞骨架发生改变。结论　CD44V6的表达与大肠癌细胞的转移潜能有关。CD44V6可能通过影响大肠癌细胞骨架的构像和分布，从而影响大肠癌细胞的运动能力，影响大肠癌转移。

　　Expression of CD44V6 and its effects on cytoskeleton in human colorectal carcinoma cell lines　Li Zuguo, Ding Yanqing, Deng Yongjian, et al. department of Pathology ,First Military Medical University,Guangzhou 510515

　　【Abstract】　Objective　To observe the expression of cD44V6 and its effects on cytoskeleton in human colorectal carcinoma(HCC) HT29 and LoVo cell lines.Methods　Expression of CD44V6 variant in hCC HT29 and LoVo cell lines was investigated by in situ hybridization, immunohistochemistry and quantitative immunofluorescence technique. The effects of CD44V6 variants on cytoskeleton was studied by immunofluorescence and confocal 3 dimension reconstruction technique.Results　CD44V6 was expressed at the mRNA and protein levels in both HT29 and LoVo cell lines, but the expression was higher in LoVo cells than in HT29 cells. When the HT29 cells and LoVo cells were blocked by monoclonal antibodies, it was found that changes developed in the cytoskeleton of these cells.Conclusions　The expression of CD44V6 is related to the metastatic potentiality of human colorectal carcinoma cells. CD44V6 may affect the distribution, polymerization and depolymerization of actin of HCC cells and promote HCC cell metastasis.

　　【Key words】　Colonic neoplasms　　Receptors, lymphocyte homing　　Neoplasm metastasis　　Actins　　Tumor cells, cultured

　　CD44V6是最早发现与肿瘤转移有关的CD44的变异体,它与肿瘤侵袭、转移有关^［1］。但CD44V6的表达与大肠癌转移的关系及其作用机制尚未明确。我们采用原位分子杂交、免疫组化、免疫荧光定量分析的方法,分析了大肠癌细胞CD44V6的表达与其转移潜能之间的关系。并应用共聚焦图像三维重构技术研究了CD44V6对细胞骨架的影响。

材料与方法

　　一、 材料

　　1.细胞株：高转移能力的大肠腺癌(LoVo)、低转移能力的大肠腺癌(HT29)细胞株均由本教研室自存，培养于含20%的小牛血清的RPMI-1640培养液中，置37℃5%的CO₂培养箱中培养。

　　2.试剂：CD44V6寡核苷酸探针由上海细胞生物所赛尔公司合成,探针序列为：5′-TGAGAT tGGGTTGAAGAAATC-3′，地高辛寡核苷酸探针标记试剂盒、地高辛寡核苷酸探针检测试剂盒购自Boehringer公司。CD44V6蛋白单克隆抗体(BBA-13)购自英国R＆D公司。LSAB试剂盒(DAKO公司)购自福州迈新公司。

　　二、方法

　　1.细胞培养及细胞片制作：HT29、LoVo细胞采用RPMI-1640完全培养基培养，置于37℃含5%CO₂培养箱内，取指数生长期的细胞用2.5%胰酶(含0.01%EDTA)消化，制成浓度为1×10⁷个/ml的细胞悬液。将此细胞悬液一滴接种于已消毒培养皿中的盖片上，加完全培育基培养48小时，然后将细胞生长状态良好的盖片取出，用0.01 mol/L PBS，pH7.2（以下均简称PBS）漂洗3次。甲醇∶丙酮(1∶1)固定液固定10分钟。

　　2.原位分子杂交分析：将制好的细胞片用10 μg/ml蛋白酶K消化，37℃，10分钟；PBS洗2分钟2次；10%缓冲多聚甲醛后固定10分钟；PBS洗2分钟2次。取200μl预杂交液95℃变性10分钟，速置冰粒中骤冷，加样于细胞标本上；平放入密封湿盒，42℃孵育3小时。取已标记地高辛的CD44V6寡核苷酸探针10μl加预杂交液200 μl构成杂交液，将杂交液95℃变性10分钟，冰粒骤冷加样于细胞标本上，平放入密封湿盒内，42℃恒温过夜。依次用6×SSC－45%甲酰胺洗10分钟，2×SSC洗10分钟2次，0.2×SSC洗10分钟2次。加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab段（1∶500稀释），37℃4小时；洗脱液(0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgCl₂) 洗10分钟；洗后加NBT/BCIP显色液（NBT/BCIP30 μl， 洗脱液1000 μl）显色2小时。镜检显色情况，用PBS冲洗，终止显色反应。经100%酒精，二甲苯处理，中性树胶封片，保存。结果判断：采用阳性记分法：在显微镜下分别随机计数300个细胞，用（-）、（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）表示细胞内mRNA表达强度：（－）不着色、（＋）细胞浆内细小稀疏蓝色颗粒、（＋＋）细胞浆内较密的细小蓝色颗粒、（＋＋＋）细胞浆内明显致密的蓝色颗粒。将结果按下面公式计算。细胞mRNA表达积分=（＋）%×1＋（＋＋）%×2＋（＋＋＋）%×3。

　　3.免疫组织化学检测：将培养在盖片上的HT29、LoVo细胞取出，用PBS漂洗3次，每次1分钟，95%酒精固定3分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，0.3%H₂O₂甲醇固定真空负压（6660kPa，以下同）条件下处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，20%山羊血清真空负压10分钟，加 cD44V6蛋白单克隆抗体（1∶125）真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，加二抗，真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，加LSAB复合物，真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，DAB显色10分钟，PBS漂洗终止显色，苏木素衬染、脱水、透明、封片。显微镜观察、照相。

　　4.免疫荧光半定量分析：将培养于盖玻片上的HT29、LoVo细胞取出，用PBS漂洗3次，每次1分钟，10%缓冲福马林固定5分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，加 cD44V6蛋白单抗真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，加FITC标记的羊抗鼠IgG（1∶50）真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，75%中性缓冲甘油封片，用共聚焦激光显微镜检测。应用ACAS master Program（V3.24）程序，选用同一参数，每种细胞随机选取6～8个视野约300个细胞进行分析。该仪器使用激光激发细胞内标记的荧光素使之发出荧光，通过光转换装置，观察荧光物质在细胞内的分布,应用计算机图像分析系统，进行定量分析和统计比较。

　　5.CD44V6影响HT29、LoVo细胞actin分布的免疫荧光检测：将指数生长期的HT29、LoVo细胞用胰酶消化，制成浓度为5×10⁵/ml的细胞悬液，实验组细胞悬液加CD44V6单克隆抗体（1∶100稀释），对照组加等量双蒸水。将细胞悬液接种于盖玻片上，置37℃、5% cO₂孵育箱内孵育24小时。将盖片取出，PBS漂洗3分钟，室温下用10%缓冲福马林固定10分钟，PBS漂洗3分钟，用滤纸吸干多余的PBS，投入冷丙酮中（－20℃）7分钟，PBS漂洗3分钟，加入actin单克隆抗体（1∶40），37℃恒温孵育180分钟，PBS漂洗3分钟，加 fITC标记羊抗兔IgG（1∶50），37℃恒温孵育180分钟，PBS 漂洗3分钟，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察，照相。

　　6.细胞骨架荧光图像共聚焦三维重构分析：将上述制好的细胞片，用570共聚集激光显微镜激光共聚焦程序分析检测，570共聚焦显微镜能从X、Y、Z三方向进行激光断层扫描，然后通过计算机对图像进行重构分析，可得出细胞内荧光物的不同断层构像和立体构像。以对细胞骨架构型变化进行分析。

结果

　　1.CD44V6在HT29、LoVo细胞系中mRNA水平表达检测：原位分子杂交实验结果显示：HT29、LoVo两种细胞系均有CD44V6 mRNA阳性信号表达。HT29细胞浆内均见有较稀疏的蓝色信号颗粒，HT29细胞mRNA信号表达强弱较一致（图1）。LoVo细胞胞浆内见致密的蓝色信号颗粒，分布较弥漫，部分细胞信号表达明显增强（图2）。HT29细胞CD44V6 mRNA表达量低于LoVo细胞，两者阳性表达的积分比为HT29∶LoVo=1.03∶2.56。

　　2.CD44V6在HT29、LoVo细胞系中蛋白水平表达检测：(1)免疫组化结果：HT29、LoVo两种细胞系均表达CD44V6蛋白。HT29细胞主要在细胞膜上表达，表达强度较一致(图3)。LoVo细胞表达强度不一致，较幼稚的细胞强阳性表达，而且胞浆内亦有

　　图1　HT29细胞胞浆内有蓝色的CD44V6信号颗粒　原位杂交×400　图2　LoVo细胞胞浆内有致密的蓝色CD44V6信号颗粒　原位杂交×400　图3　HT29细胞膜上有一致的CD44V6表达　LSAB法×400　图4　LoVo细胞膜及胞浆内有CD44V6表达，部分细胞强阳性表达　LSAB法×400　图5　对照组HT29细胞actin较集中地分布于细胞核周围，似“环状”结构　×400　图6　实验组HT29细胞actin呈解聚状态，荧光强度减弱，actin在细胞核周集中分布的现象消失，并且散在分布于细胞浆内　×400　图7　对照组LoVo细胞actin较集中地分布于细胞核周围，似“环状”结构，周围胞浆内呈细网状均匀一致的分布　×400　图8　实验组LoVo细胞acitn呈解聚状态，荧光强度减弱，actin在细胞核周集中分布的现象消失，并且散在分布于细胞浆内　×400　图9　共聚焦三维图像重构分析对照组LoVo细胞actin集中分析于核周，呈“环状”结构，细胞周边呈丝状分布　×1000　图10　共聚焦三维图像重构分析实验组LoVo细胞actin荧光强度减弱，“环状”结构消失，散布于细胞周边　×1000　(图5～10均为共聚焦激光显微镜观察)

　　表达，部分细胞则低表达（图4）。(2)免疫荧光定量分析：HT29、LoVo两种细胞CD44V6免疫荧光染色均为阳性，经ACAS-570粘附式细胞仪对荧光强度进行图像分析处理。发现HT29细胞表达强度弱于LoVo细胞。二者差异有显著性（P＜0.001）。分析见附表。

附表　HT29、LoVo细胞CD44V6表达荧光强度分析

　　3.CD44V6单抗对HT29、LoVo细胞骨架蛋白的影响：用免疫荧光技术将HT29、LoVo细胞骨架蛋白进行荧光染色，荧光显微镜观察、激光共聚焦显微镜进行平面扫描及断层扫描图像共聚焦三维重构分析发现，HT29、LoVo细胞骨架蛋白actin较集中地分布于细胞核周围，似“环状”结构，胞浆内呈细网状均匀一致的分布。经抗CD44V6单抗处理后，细胞骨架蛋白actin构像发生变化，actin呈解聚状态，荧光强度减弱，actin在细胞核周集中分布的现象即“环状”结构消失，并散在分布于细胞浆内（图5～10）。

讨论

　　CD44V6是一种最早被发现的CD44V粘附分子，这种粘附分子在有转移能力的胰腺BSp73ASML细胞中表达，而在同一肿瘤来源的无转移能力BSp73AS细胞中则不表达。将这种粘附分子基因转染至BSp73AS细胞后，则BSp73AS细胞具有转移能力，因而证实CD44V6基因是一种转移相关基因^［1］，近年来的研究发现，CD44V6也在许多其它肿瘤细胞系及人实体瘤中表达，并与肿瘤转移有关^［2，3］。我们应用原位分子杂交、免疫组化和免疫荧光定量分析技术，分别从mRNA和蛋白水平分析具有不同转移能力的人大肠癌HT29、LoVo细胞系CD44V6的表达情况，探讨CD44V6的表达与肿瘤转移的相关关系。并应用免疫荧光和共聚焦三维重构图像分析技术分析CD44V6对大肠癌细胞骨架的影响。通过上述观察和研究，探讨和分析CD44V6在大肠癌细胞系中的表达和影响转移的作用机制，进一步阐明大肠癌转移机理，为抗大肠癌肝转移研究提供理论依据。我们的实验结果显示：无论是在蛋白水平还是mRNA水平，LoVo细胞表达CD44V6的量都明显高于HT29细胞。这说明CD44V6的表达与大肠癌转移有关。与Mulder等^［2］提出的“CD44V6的表达是大肠癌转移的标志”的观点一致。我们的实验还发现：HT29细胞中，不同的细胞个体表达CD44V6 mRNA和蛋白质基本一致。而在高转移潜能的LoVo细胞中，不同的细胞个体表达CD44V6 mRNA和蛋白质不一致，部分LoVo细胞表达CD44V6 mRNA和蛋白质比其它细胞显著增强。这说明LoVo细胞表达CD44V6具有异质性。细胞骨架是细胞浆中一组由细纤维网状物质组成的网架结构，具有维持细胞形状、运动能力的功能^［4］。细胞骨架成分有微丝、微管和中间丝。微丝中的成分主要是actin,它是一种肌动蛋白丝，细胞通过actin的聚集和解聚，参与细胞的运动和伪足的形成^［5］，同时通过ankyrin与细胞外粘附分子CD44及其变异体一起参与细胞的信号传导^［6］。肿瘤细胞内actin的分布、结构和功能变化与肿瘤的生物学行为和转移能力有关^［7～11］。我们的实验结果显示，未经CD44V6单抗封闭的HT29、LoVo细胞内actin主要集中分布在细胞核的周围呈“环状”结构，部分呈细丝状分布于胞浆内。经CD44V6单抗封闭后癌细胞内actin的构像和分布发生改变，部分actin呈解聚状态，荧光强度减弱，绕核分布的“环状”结构消失，骨架蛋白散在分布于细胞浆的边缘。因此，我们认为CD44V6可能通过细胞内羧基端结构影响细胞内骨架蛋白的构像和分布，从而影响肿瘤细胞的运动能力，促进肿瘤转移的发生。

参考文献

　　1Gunthert U, Hofmann M, Rudy W, et al. A new variant of glycoprotein cD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell, 1991, 65：13-24.

　　2Mulder JW, Kruyt PM, Sewnath M, et al. Colorectal cancer prognosis and expression of exon-V6-containing CD44 proteins. Lancet, 1994, 26：344：1470-1472.

　　3Mulder JW, Kruyt PM, Sewnath M, et al. Difference in expression of CD44 splice variant between proximal and distal adenocarcinoma of large bowel. Br J Surg,1995, 82：1468-1470.

　　4Luna EJ, Hitl AL. Cytoskeleton-plasma membrane. Science, 1992, 258：955-963.

　　5Cunningham CC. Actin structural proteins in cell motility. Cancer Metastasis rev, 1992, 11：69-77.

　　6Welsh CF, Zhu D, Bourguignon LY. Interaction of CD44 variant isoforms with hyaluronic acid and the cytoskeleton in human prostate cancer cells. J Cell physiol, 1995, 163：605-612.

　　7Holme TC. Cancer cell structure: actin changes in tumour cells: possible mechanisms for malignant tumour formation. Eur J Surg Oncol, 1990, 16：161-169.

　　8Lester BR, MeCarthy JB. Tumor cell adhesion to the extracellular matrix and signal transduction mechanisms implicated in tumor cell motility，invasion and metastasis. Cancer Metastasis Rev, 1992, 11：31-44.

　　9Sadano H, Shimokawa Kuroki R, Taniguchi S. Intracellular localization and biochemical function of variant beta-actin, which inhibits metastasis of B16 melanoma. Jpn J Cancer Res, 1994, 85：735-743.

　　10Pokorná E, Jordan PW, O′ Neill CH, et al. Actin cytoskeleton and motility in rat sarcoma cell populations with different metastasis potential. Cell Motil cytoskeleton, 1994, 28：25-33.

　　11Verschueren H, Van der Taelen I, Dewit J, et al. Metastatic competence of bW5147 T-lymphoma cell lines is correlated with in vitro invasiveness，motility and F-actin content. J Leukoc Biol, 1994, 55：552-556.

(收稿：1997-07-31　　修回：1998-01-22)