大肠癌分子生物学研究的现状

世界华人消化杂志 1999年第2期第0卷 编委论坛

作者：郁宝铭　赵　任

单位：上海第二医科大学附属瑞金医院外科　200025

关键词：结直肠肿瘤；原癌基因；抑癌基因；分子生物学

　　中国图书资料分类号　R735.34

　　Subject headings　colorectal neoplasms; proto-oncogenes; genes, suppressor, tumor; molecular biology

　　近年来我国的大肠癌的发病率和死亡率均呈明显上升趋势. 对其研究的重要性渐为人们深刻认识. 大肠癌是由正常结肠上皮细胞发展成息肉样腺瘤，并最终成为癌肿变化而来；此多阶段的病理变化需要数年或数十年时间，还伴随着一系列特征性的基因改变. 这些基因包括：原癌基因、抑癌基因、DNA修复基因和其他相关基因. 随着分子生物学技术的发展和大肠癌相关知识的深入了解，人们对利用相关基因的变化作为大肠癌的预防、诊断、治疗和预后的指标产生极大的兴趣，并取得较大进展.

　　1　大肠癌基因的改变

　　从分子遗传学而言，肿瘤可认为是一种生长和遗传性状改变的细胞系^［1］. 大肠癌演变过程中，至少有5至6个基因发生变化，其过程需要数年，甚至数十年. 这个过程与临床观察到大肠癌大多发生在中老年的现象相吻合.

　　这些基因分为三类：①原癌基因，其发生突变时，成为癌基因，促使细胞异常生长. ②抑癌基因，其突变时，失去抑癌作用，无法调节细胞增殖. ③DNA修复基因，其突变时，无法按原样修复DNA，原癌基因和抑癌基因的突变.

　　1.1　原癌基因 是指在自然或实验条件下，具有潜在诱导细胞恶性转变的基因. 原癌基因编码的蛋白参与细胞增殖和分化过程. 原癌基因通过点突变、易位和扩增成为癌基因，癌基因编码有异常功能的蛋白，促使肿瘤的形成. 研究发现，K-ras癌基因可在大部分大肠癌患者中检测到. 而只有少数患者中可检测到myc,myb或neu癌基因^［2］.

　　Ras癌基因家族编码21KD的核磷酸蛋白，为P21蛋白与细胞膜联结起传递细胞内外信息的作用，也参与血管形成等. ras基因家族包括H-ras、K-ras、N-ras，Ras基因突变位于12、密码子，在大肠癌中占90%^［3］. 研究发现：ras基因突变系在早期腺瘤(直径＜1.0cm)为7%，中期腺瘤(直径＞1.0cm)为57%. 可认为ras基因突变发生于早期腺瘤向中期腺瘤转变阶段，可能是大肠腺瘤恶变的始动事件^［4］. 有趣的是，K-ras基因突变也可在相当部分非癌前病变的增生性息肉中发现.

　　1.2　抑癌基因 抑癌基因的概念来源于Knudson's RB的成因假说^［5］. 抑癌基因通过点突变、易位、插入、染色体部分甚至整个臂的缺损而失活，使细胞增殖失控，导致细胞的恶性转化^［6］. Vogelstein et al利用DNA分析技术检测大肠癌的染色体定位及杂合性丢失情况，得出与大肠关系较为肯定的抑癌基因有APC，p53，DCC,MADR2，可能有关的是FHIT，MLH1，VHL，MCC，TGF，RB，BRCA2，nm23.

　　APC基因最早在研究FAP中发现并以此命名^［7］. 其位于人第五号染色体长臂上(5q21-22)cDNA全长为8532碱基对，其15个外显子散在分布于人基因组120kb的DNA中. 其编码蛋白质有2843氨基酸组成^［8］. APC基因通过缺失、插入、点突变、易位等方式改变，致APC基因的失活可导致细胞分裂和生长异常. 研究发现：APC基因突变不仅可在FAP中发现，也可在多数散发性癌肿中发现；因此可推测，APC突变是结直肠癌发生的早期事件^［9］.

　　MCC基因紧邻APC基因，与APC有相似的基因改变，亦在大肠癌中发现.

　　p53基因位于人第17号染色体短臂上(17p)，cDNA全长16kb～20kb，有11个外显子，突变集中在第5～8号外显子. p53基因编码分子量为53KD，与DNA特殊序列联结得核磷酸蛋白，具有维持基因组DNA稳定的功能^［10］. p53基因是通过抑制DNA损伤的细胞进入G1期，使DNA有更长的时间进行自身修复，也可诱导DNA损伤的细胞凋亡. 突变细胞及时清除. p53通过点突变、转换(transversion)、转位(transition)发生基因改变，而使P53的蛋白结构和功能失去与DNA特殊序列联结的能力，使DNA损伤的细胞可能逃避正常凋亡过程^［11］. 研究发现：大约70%大肠癌有p53基因突变，而且发生在腺瘤向癌转变的最后阶段. 这提示p53基因的突变可能是腺瘤向癌转化的最关键的因素. p53是大肠肿瘤及其他人类肿瘤中最常见发生突变和缺损的基因^［12］.

　　DCC基因位于第18号染色体长臂上(18q)，编码190KD的蛋白质，是一种粘附分子，具有细胞与细胞间及细胞间质间信号传递的作用. DCC可在正常大肠粘膜表达，而在大肠癌中DCC基因缺失率为60%～80%^［13］，提示DCC基因的突变发生于癌变较晚阶段

　　TGF基因超家族所编码的蛋白质参与广泛的生理功能，包括生长调控、细胞分裂、胚胎形成等功能，故称为TGF信号传递途径. TGF家族包括：TGF-β,sactivins，DVR等. 目前发现TGF-β RⅡ基因突变时，TGF信号传递途径失活. 这一现象在遗传性非息肉样结直肠癌(HNPCC)中可观察到. 散发性结直肠癌中可发现DNA修复基因失活引起DNA的微卫星不稳定现象^［14］.

　　1.3　DNA修复基因　体内为保证DNA复制的准确性，存在DNA修复机制. DNA修复基因失活而丧失修复功能，间接促进异常细胞增殖.

　　微卫星的不稳定现象：Peinado于1992年发现在大肠癌组织的DNA中存在一种特殊的DNA小片段，含有1～5对碱基，其与第二号染色体短臂上标记有关. 这一现象也称为RER(+)：复制错误阳性.

　　DNA错配修复基因：人们通过对大肠杆菌和酵母菌基因缺损的研究发现了DNA错配修复系统的基因失活. DNA错配修复系统包括DNA错配识别、切除错配部分、按正常程序合成缺失部分等. 在细菌中，错配修复需要10种蛋白，其中MutS, MutL和MuH最为重要^［15］. 随着研究深入，人们在遗传性非息肉样结直肠肿瘤(HNPCC)中发现了MutS的同类物(hMSH2)(hMSH3)和GTBP，及其MutL的同类物(hMLH1),(hPMS1)和(hPMS2)，其中只有hMSH2或hMLH1的突变在绝大多数HNPCC中可见，其余的与之相关性不明显. DNA修复基因突变包括易位、点突变等^{［16，17］}. DNA修复基因突变的发现，提示了HNPCC及一些发生散发性大肠癌的可能通过不同遗传学途径变化而来. DNA错配修复缺损的肿瘤对烷化剂类药物化疗有一定抗药性，而对拓扑异构酶Ⅰ抑制剂较敏感. 因此从理论上而言，对肿瘤化疗具有一定的指导意义^{［18，19］}.

　　1.4　其他相关的基因　细胞周期调控基因：在大肠肿瘤中有许多基因发生改变，并通过间接方法调节细胞分裂，cyclins和CDK直接调节大肠癌细胞周期的二个因子.

　　凋亡基因：目前研究发现，与大肠癌有关的凋亡相关基因有p53,APC,Bcl-2等等. p53基因的突变在大肠肿瘤发生较晚阶段，而野生型P53的表达可介导结直肠癌细胞的凋亡. 与p53情况相似，野生型APC基因的产物也可介导大肠肿瘤细胞的凋亡^［20］. Bcl-2是人类确认的第一个抑制凋亡基因. Bcl-2基因产物可抑制由生长因子、射线、 myc表达产物介导的凋亡，但无法抑制Fas和TNF介导的凋亡. 通过检测Bcl-2表达产物分布情况，可发现正常结肠上皮细胞、腺瘤细胞、癌细胞的Bcl-2的表达是依次增强，这提示了在大肠癌形成的早期Bcl-2基因过度表达，抑制肿瘤细胞的凋亡而促进癌肿的形成^［21］. 在结直肠癌中，过度表达Bcl-2蛋白与肿瘤的多药耐药有关^［22］.

　　端粒酶：端粒是一段特殊DNA片段，位于染色体的末端，对染色体的完整和稳定起重要作用. 端粒酶是一种核蛋白酶，具有延长染色体末端，维持染色体长度的功能. 由于DNA合成系统无法复制DNA的端粒，只能由端粒酶复制而成. 在体内，只有干细胞表达端粒酶的活性，而体细胞不表达端粒酶的活性. 体细胞的染色体末端可随时间而进行缩短，最后导致其凋亡. 端粒酶在肿瘤发生过程中起重要作用，导致肿瘤无限地分裂繁殖. 这在85%以上的人类肿瘤中得到证实^［23］. 绝大多数的大肠腺瘤中未检测到端粒酶的活性，而在恶性肿瘤中端粒酶活性呈阳性^{［24，25］}. 抑制端粒酶活性作为肿瘤治疗的设想已引起了人们的兴趣.

　　2　大肠癌的分子遗传学模型

　　1974年Morson提出了腺瘤-腺瘤序列概念^［26］. 20世纪90年代，Vogelstien et al提出了大肠癌发生及进展、基因的改变是按先后顺序进行的. 即5q(APC)最早，K-ras次之，17q(p53)和18q(DCC)较晚，这一模式具有以下特征：①大肠肿瘤发生和进展的分子生物学机制主要是肿瘤基因的激活和肿瘤抑制基因的失活，而且后者占主导地位. ②在此过程中，基因突变或缺失数目逐渐增多，至少4～5个基因发生改变. 且有一个积累和协同作用. 即为Loeh提出的一个肿瘤的“突变表型”的概念^［27］. ③基因突变数量多少作为肿瘤预后的参考指标^［28］. ④基因改变的方法：点突变、易位、扩增等.

　　3　大肠肿瘤分子生物学指标检测的临床应用和意义

　　利用基因检测方法确定个体患肿瘤的倾向是下一世纪肿瘤防治的重要策略. 近来，人们在高危人群开展遗传性非息肉样肿瘤的相关基因的检测，取得一定的结果；但在社会人群中广泛进行基因检测，还面临诸多问题. 家族性息肉病(FAP)和遗传性非息肉样结直肠癌(HNPCC)是目前利用基因检测的主要的疾病之一. 在FAP患者中，其APC基因的突变率高于85%，因此可利用检测APC基因的突变，结合结肠镜检查明确诊断^［28］. 同样，对于HNPCC的患者，可先检测RER的情况，对RER+的患者进行DNA错配修复基因(hMSH2和hMLH1)突变的检测来帮助诊断.

　　肿瘤预后病理学指标有TMN分期、组织分型和细胞分级、细胞核DNA倍体及肠外血管浸润等指标. 目前研究表明，第17染色体短臂(17p)的杂合性的丧失、p53基因突变P53蛋白过度表达，与预后有一定的关系，但均不能作为独立预后指标^［29,30］；第18条染色体长臂杂合性丧失(18q)DCC，CD44，和K-ras癌基因以及蛋白酶系列中DA和MMP家族等与p53有相似的情况. 因此，将分子生物学指标作为大肠癌预后的成熟和独立的预测判断，需作进一步深入的研究、分析和评价.

　　近10a来，对大肠癌的研究有了长足的进步，明确了大肠肿瘤是由正常结肠上皮细胞转变为腺瘤样息肉，并成为癌肿的病理变化的过程. 腺瘤-癌肿的序列使人们能仔细了解与此相关病理和分子遗传学内涵，并建立了肿瘤形成的分子生物学模型. 这个模型包括原癌基因、抑癌基因和DNA修复基因变化的发生和累积的过程，其变化是按先后顺序的. 统计学表明：高于20%大肠肿瘤发生在家庭成员之间，这强烈提示着大肠癌的发生有遗传因素起作用. 在寻找遗传因素的过程中，发现了在家族性肿瘤病中APC及遗传性非息肉性大肠癌DNA错配修复基因的变化. 这些基因不仅关系到肿瘤起源，还影响到肿瘤的治疗和预后. 总之，随着分子生物学的发展，利用分子生物学检测和治疗方法，对大肠癌诊断、治疗及预后将有较大提高.

　　作者简介:郁宝铭，男，1934-12-23生，上海市人，汉族. 1956年上海第二医学院医疗系毕业，教授，主任医师，博士生导师，中华医学会外科学会肛肠外科学组组长，中华医学会上海分会普外科学会和肿瘤学会委员，《外科理论与实践》副主编，中华普通外科杂志、中国实用外科杂志、肿瘤、实用肿瘤杂志、齐鲁肿瘤杂志、世界华人消化杂志、大肠肛门病外科杂志等编委，英国剑桥世界名人协会亚洲分区副主席、国际胃肠道内外科医师俱乐部会员，主要从事大肠肛门病的诊治研究，发表论文逾百篇，著有《腹部外科学》、《胃肠手术图谱》等九部，获卫生部科技进步三等奖，国家教委三等奖、上海市科技进步二等奖三项.

　　通讯作者　郁宝铭，200025，上海第二医科大学附属瑞金医院外科，上海市瑞金二路197号.

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收稿日期　1998-08-04