体外诱导大肠癌细胞分化及其碱性磷酸酶活性的变化

中国胃肠外科杂志 1999年第1期第2卷 论著

作者：郭俊明　何小洪　罗超权

单位：郭俊明　罗超权：中山医科大学生物化学教研室(广州.510089)；何小洪：中山医科大学附属一院心内科实验室

　　关键词： 全反式维甲酸；1；25-二羟维生素D3；大肠肿瘤；诱导分化；碱性磷酸酶；细胞株

　　摘要　目的　观察单独和联合使用全反式维甲酸(ATRA)和1，25-二羟维生素D₃对大肠癌细胞株LoVo碱性磷酸酶(ALP)活性的变化的影响。方法　用不同剂量的ATRA和1，25-二羟维生素D₃单独或联合在体外作用于LoVo细胞2、4和6天，用脱氧胆酸钠溶解细胞，动力学方法测定ALP活性，紫外吸收法测定蛋白质含量。结果　单独或联合使用ATAR和1，25-二羟维生素D₃均可使LoVo细胞的肠型ALP活性逐渐升高，而以联合用药效果更好(P＜0.05)。结论　联合使用ATRA和1，25-二羟维生素D₃诱导LoVo细胞比单独用药效果更好，对于大肠癌的诊疗具要的指导意义。

The chang of alkaline phosphatases activities in large intestinal cance r cells induced in vitro

Guo Junming, He Xiaoheng, Luo Chaoquan.

　　Dep ar tment of Biochemistry, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Gunagzhou,51 0089)

　　Abstract　Objective To observe the change of alkaline phosphatases (AL P) activities in large intestinal cancer cells line (LoVo) induced by all-tra ns-retinoic acid (ATRA) and/or 1，25-dihydroxy vitamin D₃。Methods The large intestinal cancer cell line was treated by different dosag es of ATRA and/or 1，25-dihydroxy vitamin D₃ for 2,4 or 6 days. Then, the cells were dissolved in sodium deoxycholate. The ALP activities were measured by dyn amics assay and the total protein was detected by ultraviolet absorbency method.Results The intestinal type of ALP was gradually increased b y drug treatment and the effects of combinative using two drugs were better.Conclusion The differential effects of combinative using ATRA and 1,25-dihydroxy vitamin D₃ on LoVo cells were better than that of using each drug only. It had clinical significance for the diagnosis and treatment on larg e intestinal cancer.

　　Key Words All-trans-retinoic acid　1,25-dihydroxy vitam in D₃　Large intestinal neoplasm　Differentiation　Alkaline phosphatases　Cell line

　　诱导分化是继手术、放疗和化疗后治疗肿瘤的一种新方法。它的基本机制是使肿瘤细胞向正常细胞分化，从而降低其恶性度。肿瘤细胞经有效诱导后可以具有正常细胞的功能，因此，人们通过检测其功能的变化来衡量诱导是否成功^［1］。

　　Herz^［2］等报道用丁酸钠可使大肠癌细胞肠型碱性磷酸酶(Alkalinephosphatases,ALP)活性升高，并证实它是大肠癌诱导分化成功的重要指标。为研究其它诱导剂作用于大肠癌细胞后ALP活性的变化，本文用全反式维甲酸(All-trans-retinoicacid,ATRA)和1，25-二羟维生素D₃(1，25-(OH)₂VD₃)对大肠癌LoVo细胞株进行了诱导分化研究，以期为大肠癌的诊治提供理论依据。

　　材料和方法

　　一.材料

　　ATRA和脱氧胆酸钠(Sigma)；1，25-(OH)₂VD₃(Roche)；ALP检测试剂盒(Unison)。

　　二.细胞株与细胞培养

　　LoVo细胞株由本校动物中心提供，常规培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(Gibco)中。48小时弱光下换液一次。

　　三.诱导分化

　　细胞常规用胰蛋白酶消化后以1×10^-4细胞量接种到24孔板中培养24小时，去除培养基、按附表加入含不同种类和浓度诱导剂的培养基进行诱导研究。用药时间为2、4和6天。另设对照组。

附表　1，25-(OH)₂VD₃和ATRA对LoVo细胞的诱导浓度(mol/L)

　　四.ALP比活性测定

　　取对数生长期LoVo细胞，用0.125%胰蛋白酶^［2］消化成单细胞悬液，低速离心后用0.5ml0.25%脱氧胆酸钠溶解细胞，置液氮中备测。用RA-50型生化分析仪(Bayer)测定ALP活性。总蛋白测定采用紫外吸收法(HitachiU-2000型分光光度计)^［3］。ALP比活性(IU/mg)=ALP/总蛋白量。

　　五.统计学方法

　　用方差分析进行数据统计^［4］。结果

　　一.细胞形态学变化

　　对照细胞呈多形性，核浆比例大。经药物作用后，第2天便可见细胞体积变小，核浆比例减少。说明细胞已向正常细胞分化。

　　二.1，25-(OH)₂VD₃对LoVo细胞ALP比活性的影响

　　实验组ALP比活性均比对照组的高(P＜0.05)，以1×10^-8mol/L作用第4天时升高最明显(图1)。

图1　1，25-(OH)₂VD₃对LoVo细胞ALP比活性的影响

　　0：对照组；1，2分别为实验1组和2组

　　三.ATRA对LoVo细胞ALP比活性的影响

　　实验组ALP比活性均比对照组的高(P＜0.05)，以1×10^-7mol/L作用第6天时升高最明显(图2)。

图2　ATRA对LoVo细胞ALP比活性的影响

　　0：对照组；1，2分别为实验3组和4组

　　四.联合用1，25-(OH)₂VD₃和ATRA对LoVo细胞ALP比活性的影响

　　实验组ALP比活性均比对照组的高(P＜0.05)，而且逐渐升高，表现出明显的时间依赖关系。各组基本比同剂量单独用药时升高更多，表现出叠加效应(图3)。上述ALP值在65℃温育后即显著下降，这说明为肠型ALP(热不稳定型)活性。

图3　联合用药对LoVo细胞ALP比活性的影响

　　0：对照组：1-3：分别为实验5-7组

　　讨论

　　诱导肿瘤细胞分化后主要的变化有形态学改变(由多形性变成正常细胞的形态、核浆比例减小)、增殖能力和集落形成能力下降、细胞周期改变(S期比例下降)和功能方面的变化^［5］。

　　根据肿瘤细胞的来源，诱导分化的生化指标各异，表现出组织特征。如：红白血病细胞诱导分化为成熟红细胞而产生血红蛋白^［1］，鸟氨酸氨基甲酰转移酶和γ-谷氨酰转肽酶等可作为肝癌细胞诱导分化的指标^［6，7］。

　　研究表明，肠型ALP在正常肠粘膜细胞表达，而在肿瘤细胞中低表达或不表达。因此，它可作为大肠癌诱导分化的一个有效指标^［8］。用丁酸钠诱导LoVo细胞可使肠型ALP持续性升高，其机理是诱导ALP基因的表达。由于肿瘤细胞已逆转为正常大肠上皮细胞，因而具有表达ALP的功能。本研究使用ATRA和1，25-(OH)₂VD₃对LoVo细胞进行诱导分化研究，结果表明无论是单独用药还是联合用药均可见肠型ALP活性逐渐升高，而以联合用药作用更明显。说明肿瘤细胞已向正常细胞分化。实验中还发现：单独用药时，有些组ALP活性上升后会有所下降(尽管仍比对照组高)；但联合用药时ALP活性均持续上升。因此，联合用药效果更好。

　　除肠型ALP可作为大肠癌诱导分化的指标外，蛋白激酶C也是一种有用的指标。文献报道单独使用ATRA和1，25-(OH)₂VD₃均可使另一种人大肠癌细胞株CCL₂₂₉细胞的蛋白激酶C活性升高，这种信号传递系统的关键酶具有使肿瘤细胞向成熟细胞分化的重要作用^［9］。检测蛋白激酶C活性的方法比检测ALP活性的相对较复杂些。因此，本文报道的方法具有较大的应用价值。

　　总之，通过检测ALP、蛋白激酶C等生化指标可以了解大肠癌诱导分化的情况，对于大肠癌的诊断具有重要的指导意义。同时，检测肠型ALP活性为监测大肠癌患者术后情况提供了一种可能的新方法，值得进行深入研究。

　　参考文献

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