GM-CSF基因修饰、抗原预激的树突状细胞体内诱导白血病细胞分化的实验研究
中华血液学杂志 1998年第6期第19卷 论 著
作者：赵勇 曹雪涛
关键词： 树突状细胞；基因修饰；粒-巨噬细胞集落刺激因子；诱导分化；白血病细胞
摘要 目的：探讨树突状细胞在肿瘤免疫治疗过程中的作用及机制。方法：以小鼠FBL-3红白血病细胞皮下接种C57BL/6小鼠建立荷瘤模型，采用流式细胞仪分析和透射电镜等技术，观察了粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修饰的抗原预激的树突状细胞体内治疗作用。结果：采用GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗，可以明显抑制白血病细胞生长；白血病细胞表达CD14水平增加，同时MHC-Ⅱ、B7-1、B7-2、VCAM-1表达水平亦显著升高；组织学观察显示瘤组织内具有不同分化阶段的单核细胞，电镜下可见白血病细胞体积减小、细胞器较成熟、胞浆中出现较多的溶酶体、核/浆比值减小及白血病细胞的凋亡。肿瘤内部及外周血中，CD8＋细胞百分率亦较各对照组明显升高。结论：采用GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗，可以体内诱导白血病细胞向成熟单核细胞方向分化。
Studies on the in vivo induction of differentiation of the erythroleukemia cells by the antigen-pulsed dendritic cells modified with GM-CSF gene Zhao Yong, Cao Xuetao. Second Military Medical University, Shanghai 200433
Abstract Objective:To investigate the function and mechanism of dendritic cells in the immunotherapy for tumors.Methods: C57BL/6 mice inoculated with erythroleukemia cells were used as models. Inhibition or induction of tumor cell differentiation was observed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and transmission electron microscopy.Results：After pulsed with FBL-3 antigen, the GM-CSF gene transfected dendritic cells inhibited the proliferation of the tumor cells. The expression of CD14 was increased and the expressions of MHC-Ⅱ, B7-1，B7-2 and VCAM-1 were also up-regulated. Erythroleukemia cells in different differentiating stages were observed in tumor tissues. Under transmission electron microscope, the volumes of FBL-3 cells were reduced, the amount of lysosome and hetero-chromatin became plentiful, the nucleocytoplasmic ratio was decreased, and apoptosis was revealed in erythroleukemia cells. The CD8＋ cells were increased in peripheral blood and tumor tissues.Conclusion: The antigen-pulsed dendritic cells modified with GM-CSF gene could induce in vivo the erythroleukemia cells to differentiate into monocytes.
Key words Dendritic cell Gene modify Granulocyte-macrophage colony stimulating factor Induction of differentiation Leukemic cell
树突状细胞是免疫系统中一类重要的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)。在免疫应答的起动、自身免疫性疾病、移植排斥及获得性免疫缺陷综合征病毒感染过程中，发挥了重要作用［1，2］。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在维持树突状细胞的活性，促进其发育方面具有重要作用。我们采用GM-CSF重组腺病毒转染而扩增的树突状细胞，经肿瘤抗原预激后，可诱导出显著的特异性抗肿瘤免疫应答［3］。FBL-3细胞是小鼠红白血病细胞，体外采用GM-CSF诱导，可分化为单核细胞及树突状细胞［4，5］。为探讨树突状细胞在肿瘤免疫治疗过程中的作用及其机制，寻找新的诱导分化疗法，我们以FBL-3细胞建立荷瘤模型，观察了GM-CSF基因修饰的肿瘤抗原预激的树突状细胞免疫后，体内诱导分化作用。
材料和方法
1 试剂 小鼠GM-CSF重组腺病毒载体(Ad-GM-CSF)和Lac Z重组腺病毒载体(Ad-Lac Z)由日本癌症研究基金会Hamada博士惠赠，滴度分别为3.6×109pfu/ml和5.0×109pfu/ml;Ficoll-Hypaque和Percoll为Sigma公司产品；FITC-CD4、FITC-CD8、FITC-CD14、B7-1、B7-2单抗和FITC标记的羊抗大鼠二抗为PharMingen公司产品；MHC-Ⅱ单抗来源于杂交瘤细胞B21-2(ATCC TIB-229)；VCAM-1单抗来源于杂交瘤细胞M/K-1.9(ATCC CRL-1910)；树突状细胞特异性单抗来源于杂交瘤细胞33D1(ATCC TIB-227)。
2 动物和细胞株 C57BL/6小鼠，雄性，6～8周龄，购于上海必凯动物有限公司；FBL-3细胞为C57BL/6小鼠红白血病细胞，由上海医科大学何球藻教授惠赠。
3 树突状细胞的制备 小鼠脾脏来源的树突状细胞制备方法参考文献［6］进行，稍加改进。取C57BL/6小鼠的脾组织，经胶原酶(Ⅲ型)消化，以Ficoll-Percoll分层液［相对密度(旧称比重)1.080］分离，取低密度层细胞，置培养瓶中贴壁2～3小时，去除悬浮细胞，1小时后重复1次，过夜培养，收集悬浮细胞，置于已包被有人血清IgG的细胞培养皿中，静置1小时后，收集悬浮细胞。以33D1单抗检测树突状细胞的纯度(大于85%)。采用台盼蓝拒染法检测细胞活力(大于95%)。调细胞至适宜浓度备用。
4 树突状细胞的基因修饰与抗原预激 参考文献［7］。取上述树突状细胞，按病毒滴度∶细胞数=10∶1的比例，分别加入GM-CSF和Lac Z的重组腺病毒，转染12小时后洗涤，调细胞浓度为1×106/ml备用。制备GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞时，在基因修饰的同时，按树突状细胞∶肿瘤抗原=1∶10的比例，加入肿瘤抗原，共孵育12小时。肿瘤抗原采用FBL-3细胞反复冻融裂解产物制备。
5 小鼠荷瘤模型的建立与治疗 采用红白血病细胞皮下接种(每只2×106个细胞)，建立荷瘤小鼠模型。10天后，随机分组(8只/组)治疗。即GM-CSF基因转染的抗原预激的树突状细胞治疗组(Ag-GM-DC组)，GM-CSF基因转染的树突状细胞治疗组(GM-DC组)，Lac Z基因转染的树突状细胞治疗组(Lac Z-DC组)，树突状细胞治疗组(DC组)和RPMI 1640组(1640组)。治疗方式采用对侧腹股沟淋巴结周围注射，剂量为每只2×105，每周1次，治疗14天后检测诱导分化作用及其机制。
6 白血病细胞表型的分析 取皮下瘤组织，制备单个核细胞悬液，经不连续密度梯度离心后，取低密度层细胞，贴壁去除粘附细胞，收集悬浮的白血病细胞备用。分别采用FITC-CD14和MHC-Ⅱ、B7-1、B7-2、VCAM-1单抗，常规行流式细胞术(流式细胞仪为BD公司产品)检测。
7 CD4＋及CD8＋细胞的检测 小鼠肝素化后，取外周血(3只/组)，分别加入FITC-CD4、FITC-CD8单抗，常规行流式细胞术检测；检测瘤组织内CD4＋及CD8＋细胞时，取瘤组织制备单个核细胞悬液，然后行流式细胞术分析。
8 病理及透射电镜样品的制备 分别取瘤组织，用0.01mol/L的PBS(pH7.2)洗涤后，经2.5%戊二醛固定，按常规制备样品，透射电镜观察并拍照；同时，分别用10%的甲醛固定，制备病理切片。
9 统计学处理 采用两样本均数比较的t检验。
结果
1 GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞体内抑制白血病细胞生长的作用(见表1) 采用GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞体内免疫后(Ag-GM-DC组)，可以明显抑制白血病细胞的生长，与GM-DC组比较差异显著(P＜0.05)。提示，GM-CSF基因修饰的树突状细胞经抗原预激后作用增强。采用Lac Z基因修饰的树突状细胞治疗(Lac Z-DC组)，及单用树突状细胞治疗(DC组)，亦可抑制白血病细胞生长，与1640组比较有明显差异(P＜0.05)。
表1 GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞体
内抑制白血病细胞生长的作用
| Ag-GM-DC组 |
0.04±0.01 |
| GM-DC组 |
0.11±0.01 |
| Lac Z-DC组 |
0.15±0.02＃ |
| DC组 |
0.16±0.01＃ |
| 1640组 |
0.22±0.04 |
*与GM-DC组比较，P＜0.05；
#与1640组比较，P＜0.05
2 GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗后白血病细胞表型的变化 CD14是单核-巨噬细胞的特异标志。取不同治疗组的瘤组织，经分离纯化白血病细胞后，行流式细胞术分析。CD14细胞表达阳性率，Ag-GM-DC组为32.64%±0.05%， 1640组为12.07%±0.02%，二者有明显差异(P＜0.05)；MHC-Ⅱ抗原由12.16%±0.01%升至20.21%±0.03%。提示，采用GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗，可以促进红白血病细胞向成熟单核细胞方向分化。以Ag-GM-DC组和1640组为例，比较共刺激分子B7-1、B7-2、VCAM-1等的表达，Ag-GM-DC组分别是44.75%±0.04%，36.77%±0.03%，14.89%±0.01%；1640组分别是19.06%±0.02%，4.14%±0.01%，4.76%±0.01%，可见Ag-GM-DC组的上述分子表达水平明显升高(P＜0.05)。提示，Ag-GM-DC组治疗后的红白血病细胞可能增强了免疫原性。
3 GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗后病理及白血病细胞超微结构的变化
3.1 肿瘤组织的光镜观察：观察GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗后肿瘤的组织学变化，可见不同分化阶段的单核细胞及粒细胞，亦见较多的炎性细胞浸润；采用RPMI 1640治疗的对照组，肿瘤细胞未见明显分化，组织坏死程度较轻，周围有少量炎性细胞浸润。
3.2 白血病细胞超微结构的观察：采用1640治疗组，白血病细胞的透射电镜示，细胞体积大，呈圆形或卵圆形，胞浆中颗粒极少，细胞器不发达，核/浆比值大，细胞核中常染色质丰富，核仁大。采用GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗(Ag-GM-DC组)后，白血病细胞超微结构的变化显示，细胞体积减小，胞浆中溶酶体增多，线粒体数量增多，核/浆比值减少，细胞核异染色质丰富。比较各组间差异，上述变化以Ag-GM-DC组最为明显。进一步观察，可见Ag-GM-DC组有较多的肿瘤细胞发生凋亡，有核浓缩，核分裂及凋亡小体形成。
4 GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗后外周血及瘤内CD4＋及CD8＋细胞的变化 比较各组治疗后外周血中CD4＋及CD8＋细胞的变化(表2)，可见Ag-GM-DC组CD8＋细胞水平明显高于对照组(P＜0.05)。以Ag-GM-DC组和1640组为例，比较肿瘤局部CD4＋及CD8＋细胞浸润程度，可见Ag-GM-DC组CD8＋细胞水平明显高于1640组(P＜0.05)，CD4＋细胞水平各组间无明显差异(P＞0.05)。提示，在诱导红白血病细胞分化和凋亡过程中，CD8＋细胞可能发挥了重要作用。
表2 GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞治
疗后外周血及瘤组织内CD4＋及CD8＋细胞的变
化(
±s)
| 部位 |
组别 |
CD4＋细胞(%) |
CD8＋细胞(%) |
| 外周血 |
Ag-GM-DC组 |
22.72±0.02 |
33.17±0.02 |
| |
GM-DC组 |
18.12±0.03 |
28.79±0.01 |
| |
Lac Z-DC组 |
15.54±0.02 |
23.71±0.02 |
| |
DC组 |
19.46±0.01 |
24.37±0.02 |
| |
1640组 |
16.01±0.02 |
23.96±0.02 |
| 瘤组织 |
Ag-GM-DC组 |
6.67±0.01 |
14.00±0.02 |
| |
1640组 |
5.12±0.01 |
4.67±0.01 |
外周血及瘤组织Ag-GM-DC组与1640组比较，P均＜0.05
讨论
树突状细胞富含MHC-Ⅱ、B7、ICAM-1等免疫应答相关分子，可以激活静息的T细胞或记忆性T细胞，是目前发现的一类功能最强的抗原提呈细胞。树突状细胞在免疫应答过程中的作用，日益受到人们的重视。关于采用树突状细胞进行肿瘤细胞诱导分化的研究，尚未见报道。CD14是单核-巨噬细胞的特异标志。GM-CSF基因修饰的树突状细胞经抗原预激后进行治疗，其抑瘤作用明显，白血病细胞表达CD14水平明显增加。提示GM-CSF基因修饰的树突状细胞治疗后，白血病细胞向成熟单核细胞方向分化。通过观察作用后FBL-3细胞超微结构的变化，胞浆中出现较多的溶酶体，亦提供了有力的证明。在分析白血病细胞表型的变化时，发现肿瘤组织内有少量活化的单核-巨噬细胞浸润，可表达CD14；由白血病细胞分化的单核细胞，与正常的单核细胞相比，CD14的表达水平较低，提示两者之间可能有本质差异。
机体对肿瘤细胞的免疫排斥，主要依赖于T细胞，特别是CD8＋的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。检测外周血和肿瘤组织CD4＋和CD8＋细胞，发现基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗后，CD8＋细胞百分率升高。提示，CD8＋ T细胞在上述治疗过程中发挥了重要作用。T细胞的活化需要两类信号：一类是传统的特异抗原提呈信号；另一类是非特异的共刺激信号。缺少了共刺激信号，T细胞不能对肿瘤细胞产生有效的免疫应答。树突状细胞可通过高表达MHC-Ⅱ、B7-1和B7-2，分泌IL-12等机制，有效地活化T细胞［8，9］。上述抑制白血病细胞生长和诱导分化作用，可能与此有关。我们在观察白血病细胞超微结构的变化时，亦发现CTL与白血病细胞密切接触(资料未显示)。文献报道，活化的树突状细胞可以高表达IL-12等细胞因子。我们的研究结果表明，GM-CSF、IL-12体外可以直接作用于白血病细胞，诱导其向成熟单核细胞方向分化(待发表)。GM-CSF基因修饰的树突状细胞可以高表达GM-CSF。GM-CSF和IL-12都可有效地活化CTL，增强其活性。因此，GM-CSF基因修饰的抗原预激的树突状细胞具有诱导分化作用，可能与多种机制参与有关。
血管细胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)属于免疫球蛋白超家族成员，通过与其配体VLA-4结合发挥作用。Damle等［10］报道，与B7相比，VCAM-1/VLA-4对T细胞的活化亦具有明显的共刺激作用。检测治疗后的白血病细胞(FBL-3)表型的变化，发现不仅MHC-Ⅱ分子表达水平，而且B7-1、B7-2、VCAM-1等共刺激分子表达水平亦显著增加。提示，分化后的白血病细胞可能具有抗原提呈功能，可把自身抗原提呈给T细胞，增强了抗肿瘤免疫应答，更有利于白血病细胞的消除。这为白血病的免疫治疗开辟了一条新的途径。
参 考 文 献
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4 赵勇，曹雪涛. 重组GM-CSF对小鼠红白血病细胞诱导分化和凋亡的影响. 中华医学杂志，1997，77：620-621.
5 赵勇，曹雪涛. GM-CSF诱导红白血病细胞向树突状细胞分化及其抗原提呈功能的研究. 中华医学杂志，1997，77：732-736.
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8 Larsen CP, Ritchie SC, Hendrix R, et al. Regulation of immunostimulatory function and costimulatory molecule (B7-1 and B7-2) expression on murine dendritic cells. J Immunol, 1994, 152: 5208-5219.
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10 Damle NK, Klussman K, Linsley PS, et al. Differential costimulatory effects of adhesion molecules B7, ICAM-1, LFA-3 and VCAM-1 on resting and antigen primed CD4＋ T lymphocytes. J Immunol, 1992, 148:1985-1992.
(收稿：1997-05-15 修回：1997-12-01)
(校对：王叶青)
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