肿瘤抑制基因CDKN2/p16与肺癌
癌症1999年第18卷增刊
苏长青综述 单祥年审校
关键词：肺肿瘤；肿瘤抑制基因
中图号：R734.2；R730.23；R394.3
近几年来，分子生物学对肺癌发生机制研究的突破性进展之一，就是确立了原癌基因和抑癌基因对肺癌细胞的重要调控作用。目前已发现的原癌基因有100多个，抑癌基因也超过12个〔1〕。其中新发现的抑癌基因CDKN2/p16因在很多人类肿瘤中有频繁的突变率和抑癌作用，受到人们的广泛关注，它的突变与肺癌发生的关系成为近来研究的热点。
1 CDKN2/p16基因的发现及其结构
CDKN2/p16基因的发现可追溯至1992年，当时Skolmick领导的研究小组在寻找皮肤黑色素瘤易感基因时，发现9p21区位是一个多肿瘤抑制基因的所在地，此区的突变在包括黑色素瘤在内的很多种肿瘤中普遍存在〔2〕。1993年，Serrano等〔3〕利用酵母双杂合蛋白相关性筛选法研究与细胞周期素依赖激酶(CDK4)作用的蛋白时，发现并分离出CDK4特异性的抑制蛋白CDK4Ip16蛋白，同时克隆了p16的cDNA。1994年，Kamb等〔1〕和Nobori等〔4〕对9p21区位进行了染色体位移、物理图和序列标记位点图分析以及DNA序列分析，发现了与Serrano等报道的p16cDNA相同序列的多肿瘤抑制基因，命名为MTS1(MultipleTumorSuppressorI)，后被HUGO(HumanGenomeOrganization)正式命名为CDKN2(CyclinDependentKinaseInhibitor2)〔5〕。
CDKN2/p16基因定位于人类染色体9p21，全长8.5kb，含3个外显子和2个内含子，第1、2、3外显子分别由126bp、307bp、11bp构成。CDKN2/p16基因有两种不同的转录方式，分别由启动子Pα和Pβ调控。Pα启动的转录物由全部3个外显子组成，翻译产物即为CDK4的抑制因子p16，相对分子量为15845，该蛋白为一含有148个氨基酸开放阅读框架的单链多肽，并有4个回钩状重叠结构组成其空间构型，以保持其蛋白活性。Pβ启动的转录物由位于外显子1上游约20kb处的268bp外显子1β，取代了外显子1，编码产物为截短了的p16，这种β型转译形式可能是该基因甲基化失活的一种方式〔6〕。
2 CDKN2/p16基因的作用机制
细胞周期的正常演进依赖于周期蛋白的调节而完成，使细胞处于增殖和增殖抑制的动态平衡之中。真核细胞的有丝分裂有两个重要的检查限速点(Checkpoint)，即G1→S卡点和G2→M卡点，其中以G1→S卡点尤为重要。CyclinD1、CDK4、Rb和CDKN2/p16是G1→S限速步骤中重要的调节组件〔7，8〕，非磷酸化Rb蛋白结合到转录因子E2F-DNA复合物上，在启动子上阻断mRNA的转录，同时又活化转录因子ATF-2，促进细胞分裂抑制因子的转录，从而阻止细胞的生长繁殖。当CDK4与CyclinD1结合形成复合物时，CDK4被激活而具有蛋白激酶活性，它作用于Rb蛋白使之磷酸化失活，释放出转录因子E2F，E2F活化C-myc、N-myc、胸苷激酶，二氢叶酸还原酶、DNA聚合酶等进入S期必需的酶蛋白基因的转录，从而使细胞越过G1→S卡点，促进细胞增殖〔8〕。p16蛋白能够与CyclinD1竞争结合CDK4，特异地抑制CDK4的活性，使Rb蛋白不被磷酸化而保持活性状态。因此G1→S的过渡取决于CyclinD1与p16蛋白的相对活性〔3，7，8〕。最新研究表明，正常细胞中CyclinD1在G1期呈一过性表达，它所引起的Rb功能下调释放E2F，对CDKN2/p16基因也有转录促进作用，进而抑制CDK4活性，调控细胞从G1期到S期的转变过程。
3 CDKN2/p16基因失活机制与肺癌的发I?
CDKN2/p16基因是由其编码产物执行抗癌功能的，从基因结构、转录过程到蛋白翻译任何环节上的异常均可使之失活。CDKN2/p16基因在肺癌等很多人类原发肿瘤和细胞系株中发生改变，其形式有纯合缺失、杂合缺失伴几个碱基或单个碱基的缺失或突变、上游调控序列CpG岛的过度甲基化等〔9～12〕。
3.1CDKN2/p16基因缺失或突变
CDKN2/p16纯合缺失是该基因失活的优势方式，而基因内几个或单个碱基的改变并不是主要的。Washimi等〔13〕在20例非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株中检出6例CDKN2/p16基因纯合缺失，2例有PCRSSCP泳动变位，而20例小细胞肺癌(SCLC)均未发现该基因的变化。可见缺失更常见，且是NSCLC区别于SCLC的特征性改变。Shapiro等〔11〕和Xiao等〔14〕对NSCLC的研究证实，CDKN2/p16碱基突变的形式有无义突变、错义突变(碱基颠换或转换)、单碱基插入或一至数个碱基缺失所致的移框突变等。进一步的研究表明，NSCLC细胞系中CDKN2/p16基因缺失和突变的总检出率约70％，而在原发肿瘤组织中却只有不到30％〔15，16〕。Kinoshita等〔15〕认为原发肿瘤组织中CDKN2/p16基因缺失和突变检出率低，可能是混入间质细胞的原因。有关CDKN2/p16基因缺失和突变与肺癌分期或转移的关系，文献报道有所差异。Okamoto等〔16〕发现，CDKN2/p16基因的改变仅见于转移性NSCLC，而在原发的NSCLC则未检出该基因的缺失和突变，结果支持CDKN2/p16基因的遗传学改变是NSCLC进展中的晚期事件。另一项研究与此相反，p16蛋白的丢失与NSCLC临床分期无关〔15〕，结果支持p16丢失早于该基因遗传学上的改变，是NSCLC发生发展中较早期的事件之一。
3.2CDKN2/p16基因CpG岛甲基化
除频发的纯合缺失以外，CDKN2/p16基因上游5－端启动子区域的CpG岛高度甲基化，致使基因转录终止，是该基因失活的又一重要方式，而且是那些低频率突变的肿瘤细胞发生基因失活的主要途径〔7，12，13，17〕。实验证实〔17〕，CpG岛高度甲基化约有38％，可见其在基因失活中的作用并不亚于基因缺失，CpG岛高度甲基化致转录子丢失，与杂合缺失中存留等位基因失活有关。CDKN2/p16基因甲基化后将无法测到完整的p16mRNA，cDNA克隆可寻找到另一个次1号外显子E1β，这种β型转译的次1号外显子可以和2、3号外显子形成完整的转录子，该转录子在体内并不翻译，但在体外可翻译得到一个序列相异且无功能的p16蛋白〔6〕。因此在分析CDKN2/p16表达时，选用的探针序列应包括E1β，这样才能进行正确的判断。值得一提的是，因CpG岛甲基化关闭的基因在给予抗甲基化药5脱氧氮杂胞嘧啶(5－deoxyazacytidine)后，可以脱甲基化而恢复正常转录〔17〕。目前有关肺癌CDKN2/p16基因CpG岛甲基化的报道还很少见〔18〕，但这对于解释那些CDKN2/p16基因正常而无相应mRNA、或有p16mRNA转录而无p16蛋白的肺癌病例有很大帮助。除基因缺失、突变、甲基化以外，还有一部分病例的基因失活或p16丢失不能得到解释，可能还存在着其它的基因灭活机制，有待于进行更深入的研究。
3.3p16与Rb的相关性
CDKN2/p16基因调节细胞周期的抑制机制，是通过Rb依赖性途径来实现的，因此p16蛋白和Rb蛋白表达的相关性受到人们的重视。Shapiro等〔19〕对10个NSCLC和5个SCLC细胞系的研究发现，9例野生型Rb阳性NSCLC细胞系均有p16蛋白缺失或水平下降，而野生型Rb阴性的1例NSCLC和5例SCLC细胞系显示高水平p16蛋白。在原发癌组织中也有上述p16与Rb之间的反向相关关系〔15，19〕，这种交互性在肺癌的早期就已经存在〔20〕，可以作为NSCLC和SCLC诊断和鉴别的指标。结合CyclinD1的研究，发现CyclinD1的过度表达是原发性肺癌(包括NSCLC和SCLC)常见的分子异常之一〔19〕。在Rb和p16之间包含的CDK4、CyclinD1及转录因子介导的细胞周期负反馈调节环路中，Rb和p16任何一个表达缺失导致的调节环路的中断，都足以使G1期细胞失调性增殖。Rb阳性的NSCLC过度表达CyclinD1而使Rb失活，Rb阴性的SCLC和极少数NSCLC不依赖于CyclinD1的过度表达而呈高水平p16。由此看来，单独高表达的p16蛋白或Rb蛋白都无法发挥其阻止细胞增殖的负调控作用。
4 CDKN2/p16基因在肺癌中的应用展望
CDKN2/p16基因失活涉及肿瘤之广、突变及缺失率之高，超过了我们所知的任一抑癌基因，又由于其作用于CDK4的特异性强，基因小而易于操作，因此其在肺癌治疗方面有良好的前景，成为人们进行基因治疗的靶基因之一。Jin等〔21〕构建含完整野生型CDKN2/p16cDNA序列的重组质粒pAd/p16，该质粒含人类CMV启动子，采用磷酸钙法转染CDKN2/p16基因缺失的NSCLC细胞株，经Southernblot、PCR和Westernblot检测，转染的细胞获得p16蛋白的表达，流式细胞术测得细胞生长受抑制，G1期细胞增加，S期细胞下降。将转染的细胞接种BALB/c小鼠，发现肿瘤成瘤能力下降，移植瘤生长缓慢。结果显示转染CDKN2/p16基因在体内和体外均可以阻断肺癌细胞由G1向S期发展，抑制癌细胞增殖。国内也已有人开展这方面的工作〔22〕，运用分子克隆技术构建重组人CDKN2/p16基因表达载体pcDNA3/p16，通过电穿孔法将该基因导入人肺腺癌NCIH460细胞中，发现导入CDKN2/p16基因能使人肺腺癌细胞生长速度明显减慢，克隆形成率下降，细胞周期G1阻滞。结果证明，基于恢复CDKN2/p16基因功能的基因治疗方法，在肺癌治疗方面有广阔的应用前景。
综上所述，作为CDK4的特异性抑制因子，CDKN2/p16基因在肺癌中的高失活率毫无疑义地证明，该基因在肺癌的发生发展中扮演着十分重要的角色。CDKN2/p16基因的失活至少存在着三种机制，即纯合缺失、甲基化和基因突变，以前两者为主〔23〕。由于CDKN2/p16基因产物能够阻断细胞周期的进行，抑制细胞增殖，因而成为肺癌基因治疗的靶基因之一。有关CDKN2/p16基因的作用机制和临床应用还有待于进一步研究，未来的工作将致力于对该基因上游序列的研究，重点探讨基因表达调控的机制，为基因治疗肿瘤、改善肿瘤的临床进程创造条件。
作者单位：苏长青综述 南京八一医院全军肿瘤研究中心(南京，210002)
单祥年审校 南京师范大学生命科学学院
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编辑及校对：杨允贵
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