肺癌组织p53和K-ras基因突变及其表达产物检测的意义

　　第四军医大学学报1999年第20卷第9期

张贺龙　王文亮　胡灵芝

　　摘　要　目的：研究肺癌组织中p53和K-ras基因突变、蛋白表达，以及二者的关系.方法：应用PCR-SSCP和免疫组织化学方法分别检测肺癌组织中的p53和K-ras基因突变和蛋白表达.结果：肺癌组织中检测到p53和K-ras基因的突变分别为53%和14%，肺癌组织中检测到p53蛋白和p^ras21蛋白的积聚分别为58%和19%.结论：p53和K-ras基因突变与肺癌发生关系密切，其基因突变与蛋白的积聚之间存在一致的关系，但并非完全对应.p53和K-ras基因突变及其表达产物的检测对肺癌患者有一定的辅助诊断意义.

　　关键词：肺肿瘤　p53　基因，ras

　　0　引言

　　肺癌的发生与多种癌基因和抑癌基因有关，其中癌基因K-ras和抑癌基因p53与肺癌的发生、发展有着密切的关系，本实验应用PCR-SSCP技术对肺癌组织的K-ras和p53基因突变情况进行了检测，并应用免疫组织化学方法对其表达蛋白同时进行了检测,以探讨其意义.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　选取我院住院肺癌患者36（男24，女12）例，年龄41岁～72岁，平均（58.2±8.2）岁，据TNM分期标准，Ⅱ期14例，Ⅲ期22例；鳞癌18例，腺癌12例，小细胞肺癌4例，大细胞癌2例.取患者手术切除的新鲜肺癌组织，-70℃保存备用.另取随癌切除的正常肺组织20例作为对照.保存的冷冻组织用于PCR检查，对应的组织石蜡切片用于免疫组化分析.

　　1.2　方法　DNA用酚-氯仿法提取，行PCR扩增.PCR试剂盒购自华美生物技术公司，引物设计针对K-ras基因第12位密码子和p53基因第5～8外显子，由中科院上海生化所合成.引物序列为：K-ras:上游引物：GACGGAATATAAGCTGGTGG，下游引物：TTCGTCCACAAAATGGTTG T110bp；p53:Exon5:5′-CTTTCAACTCTGTCTCCTTC-3′ 3′-TGGGCAACCAGCCCTGTCGT-5′180bp;Exon6: 5′-CCCCAGGCCTCTAGTTCCTC-3′ 3′-CTCACCCGGAGGGCCACTGA-5′111bp;Exon7: 5′-TGCCACAGGTCTCCCCAAG-3′ 3′-GGGCACA GCAGGCCAGTGTG-5′108bp;Exon8:5′-GGACAGGTAGGACCTGATTTC-3′ 3′-AATCTGAGGCATAACTGCAC-5′132bp.一部分PCR反应产物行琼脂糖电泳，检验扩增效果.

　　SSCP分析：制备聚丙烯酰胺凝胶（80g/L）；取10μLPCR产物，加入10μL变性剂(950g/L甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.2g/L溴酚蓝)、30μL石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10℃～15℃下电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含0.5g/L溴化锭的1×BE缓冲液中染色30min～45min，在紫外灯下观察.肺癌组织中p53和p^ras21蛋白的检测采用ABC法，蜡块切片脱蜡、脱水，700W微波处理修复抗原.试剂购自武汉博士德生物技术公司，光镜下细胞核有棕色颗粒着色为阳性反应.

　　2　结果

　　2.1　肺癌组织中p53，K-ras基因突变的检测　36例肺癌组织中，19例检测出p53基因的突变，阳性率为53%.其中鳞癌10例，腺癌5例，小细胞肺癌3例，大细胞癌1例；Ⅱ期肺癌患者6例，Ⅲ期肺癌患者13例(Fig1).36例肺癌患者中，5例检测到K-ras基因第12位密码子的突变，阳性率为14%.其中鳞癌2例，腺癌3例，在小细胞肺癌和大细胞癌患者中未发现K-ras基因的突变.鳞癌中K-ras基因突变阳性率为11%，腺癌中K-ras基因突变阳性率为25%.5例阳性病例中，Ⅱ期肺癌2例，Ⅲ期肺癌3例(Fig2).2例患者肺癌组织中同时检测到p53和K-ras基因的突变，22例肺癌患者组织中检测到p53或K-ras基因的突变，阳性率为61%.

图1　肺癌组织中p53基因突变PCR-SSCP分析结果

　　fig1　The PCR-SSCP result of p53 gene mutations in lung cancer tissue

　　M.DNA marker;2.p53 gene exon5;4.p53 gene exon6;6.p53 gene exon7;8.p53 gene exon8;1,3,5,7.Controls.

图2　肺癌组织中K-ras基因PCR-SSCP分析结果

　　Fig2　The PCR-SSCPresultofK-rasgenemutationinlungcancertissue

　　M.DNAmarker;1.Lung cancer tissue;2.Normal tissus.

　　2.2　肺癌组织中p53和p^ras21蛋白的检测　36例肺癌患者中，有21例检测到p53蛋白，阳性率为58%，其中鳞癌61%（11/18），腺癌50%（6/12）,小细胞癌75%（3/4），大细胞癌2例中有1例；7例检测到p^ras21蛋白，阳性率为19%，其中鳞癌11%（2/18），腺癌42%（5/12）.小细胞肺癌和大细胞肺癌中未检测到p^ras21蛋白的过表达.对于p^ras21蛋白，腺癌中的阳性率明显高于其它组织类型肺癌（P＜0.01）.95%(18/19)有p53基因突变和80%（4/5）有K-ras基因突变的肺癌组织中都可以检测到相应的表达蛋白，86%（18/21）有p53蛋白积聚和57%（4/7）有p^ras21癌蛋白积聚的患者的肺癌组织中都可以检测到相应的基因突变,但基因突变和蛋白积聚间并非完全对应关系.对照20例对照组织检测结果为阴性.

　　3　讨论

　　肺癌的发生是一个复杂的、渐进的、多步骤的过程，涉及的因素很多.癌基因和抑癌基因理论的发展，使人们能在分子水平上更深入地认识肺癌，为最终治愈肺癌提供了更大的可能.肺癌的发生、发展过程当中，可有多种癌基因或/和抑癌基因的异常，如ras，myc,c-erbB-2,p53,Rb等.ras基因家族包括K-ras,N-ras,H-ras，其中与肺癌关系比较密切的主要是K-ras癌基因，在肺癌中，K-ras基因的改变主要是点突变，常发生于12,13和61位密码子处，其中以第12位密码子处突变率最高.K-ras基因突变主要发生于非小细胞肺癌，且以腺癌中的突变率最高^［1,2］.抑癌基因p53异常在肺癌中的发生率较高，p53基因异常以点突变为主，突变主要发生于p53基因的4个高度保守区，即第5～8外显子.PCR-SSCP技术是聚合酶链式反应（PCR）与单链构象多态性分析（SSCP）结合而形成的一项新技术，可用于检测出基因的单个碱基的突变.本实验应用PCR-SSCP技术对肺癌患者手术切除肺癌组织的K-ras和p53基因突变情况进行了检测，发现53%的肺癌组织中有抑癌基因p53的突变，说明p53突变在肺癌中比较普遍.在14%的肺癌组织中检测到K-ras基因的突变，K-ras基因的突变主要发生于非小细胞肺癌（17%），且以肺腺癌中的突变发生率最高（25%），这与以往的研究报道一致^［1,2］.

　　关于p53基因突变是肺癌发生的早期事件还是晚期事件，至今尚无完全一致的意见^［3,4］.许多研究认为p53基因突变发生于肺癌发生的早期^［5,6］，有可能成为肺癌早期诊断的一个很有用的标志物.本实验结果显示，p53基因突变在II期和III期肺癌患者中的检出率无明显的差异（P＞0.05），分别为43%（6/14）和59%（13/22），似支持p53基因突变是肺癌发生的早期事件的观点.检测肺癌组织的基因改变及其表达蛋白，可用于肺癌的辅助诊断，K-ras基因的突变和P^ras21蛋白的表达主要发生于非小细胞肺癌，且以肺腺癌中的突变发生率最高，据此可以帮助鉴别小细胞型肺癌和非小细胞型肺癌.检测肺癌患者的基因突变情况还可以帮助判断肺癌患者的预后^［7,8］.有p53或K-ras基因突变的肺癌患者预后较无p53基因或K-ras基因突变的患者的预后差.检测肺癌组织中p53蛋白的表达不仅对肺癌诊断有意义，而且，对预测肺癌的发生，进行肺癌的早期诊断也具有重要的意义^［9］.有p53基因突变的肺癌患者，其组织标本中常同时存在突变的p53蛋白的表达，但也有一部分患者，其基因改变和蛋白表达的检测结果不一致，具体原因尚不完全清楚.原因之一可能是除了第5～8外显子突变外，还有其它部位基因的突变，也可能还存在其它的基因改变机制.同样的情况也发生在K-ras基因和p^ras21蛋白的检测中.总之，肺癌组织中可检测出K-ras基因和p53基因的突变，还可检测出其基因表达产物，说明K-ras基因和p53基因的突变与肺癌的发生有密切关系.通过对K-ras和p53基因突变及其表达产物的检测，可进行肺癌的辅助诊断，有助于区分肺癌的组织类型，还可以帮助判断肺癌患者的预后.

　　作者简介：张贺龙，男，1964-09-20生，河北省黄骅市人，汉族.1986年第四军医大学毕业.博士，讲师.发表论文9篇.电话：（029）3578155

　　 作者单位：（张贺龙　胡灵芝）第四军医大学：唐都医院肿瘤科，陕西　西安　710038

　　（王文亮）基础部病理学教研室

　　参考文献

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