肺癌组织MDR1和GST－πmRNA水平测定及其临床意义

　　中国肿瘤临床1999年第22卷第3期

戴广海　石廷章　李春海

　　 摘要　目的：分析肺癌组织MDR1和GST－π基因的表达和临床意义。方法：运用RT－PCR方法对51例手术切除肺癌组织和相应的癌周正常肺组织进行MDR1和GST－πmRNA检测。结果：MDR1mRNA在正常肺组织和肺癌组织中表达阳性率分别为13.7％(7/51)和43.1％(22/51)；而GST－πmRNA阳性率则分别为19.6％(10/51)和51.0％(26/51)。MDR1或GST－πmRNA表达与肿瘤病理类型、组织分化、TNM分期等均无明显的相关性（P＞0.05）。19例（37.3％）发生MDR1和GST－πmRNA共表达；22例（43.1％）二者均无表达；7例（13.7％）仅表达GST－πmRNA；3例（5.9％）仅表达MDR1mRNA。结论：肺组织细胞在恶变过程中MDR1和GST－πmRNA表达均有所增加，二者在肺癌先天性耐药机制中均占有重要的作用，而且二者在肺癌中的表达基本是一致的。

　　关键词：肺癌MDR1GST－πRT－PCR

　　多药耐药性（MDR）是肺癌尤其是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的最大障碍。近几年来研究表明P－gp不是产生MDR的唯一机制。除P－gp以外某些其它蛋白如MRP（多药耐药相关蛋白）等也参与调节细胞内药物的浓度；某些靶酶如GST（谷胱甘肽S－转移酶）同工酶、TopoⅡ（拓扑异构酶）等的改变也与MDR有关^[1,2]。本研究对51例未经任何抗肿瘤治疗的肺癌患者手术切除标本应用RT－PCR（逆转录－多聚酶链反应）法进行MDR1和GST－πmRNA水平测定，一方面探讨MDR1基因和GST－π基因在肺癌及癌周正常肺组织中的表达状况；另一方面研究两者在肺癌先天性耐药机制中的作用及其相关性。

　　1　材料与方法

　　1.1　引物

　　GST－π引物由德国教授惠赠，其序列为：5′CAGGAGGGCTCACTCAAAG3′(sense);5′CAGGTTGTAGTCAGCGAAG3′(antisense)，扩增片段为350bp。MDR1引物由军事医学科学院二所合成，其序列为：5′GTACCCATCATTGCAATAGC3′(sense);5′CAAACTTCTGCTCCTGAGTC3′(antisense),扩增片段为150bp。β2微球蛋白引物由军事医学科学院二所合成，序列：5′ACCCCCACTGAAAAAGATGA3′(sense);5′ATCTTCAAACCTCCATGATG3′(antisen－se)，扩增片段为120bp。

　　1.2　标本来源及储存

　　所有标本均来自我院胸外科肺癌手术患者，时间自1994年10月～1995年10月，共51例肺癌组织和51例相应的癌周正常肺组织标本，手术后立即取材并储存于液氮中。病例包括男性35例，女性16例；年龄32～72岁，中位年龄54岁。其中腺癌23例，鳞癌16例，腺鳞癌8例，小细胞肺癌2例，大细胞肺癌1例，肺软组织肉瘤1例。所有病例手术前未行任何抗肿瘤治疗。

　　1.3　组织中总RNA的提取及鉴定

　　组织中总RNA的提取—AGPC一步法^[3]，总RNA的纯度鉴定计算0D260/0D280和0D260/0D230比值。总RNA完整性鉴定—甲醛变性凝胶电泳^[3]。

　　1.4　cDNA的合成

　　参见分子克隆^[3]。

　　1.5　PCR测定MDR1/GST－πmRNA

　　参见分子克隆^[3]。

　　1.6　统计处理

　　χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　组织中提取总RNA样品鉴定

　　0D260/0D280一般在1.8～2.1之间，说明蛋白已基本去除。0D260/0D230＞2，表明无异硫氰酸胍残留，所提RNA的浓度为0.8～2.0μg/μl。RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S和5SRNA条带清晰，表明RNA分子量完整，没有降解现象。

　　2.2　MDR1/GST－πmRNA结果及判定标准

　　以MDR1/GST－π条带与β₂微球蛋白基因条带扫描值比较，结果≥1为阳性，＜1为阴性。

　　2.3　肺癌及癌周肺组织MDR1mRNA表达

　　表1显示肺癌组织表达明显高于癌周肺组织，提示肺组织细胞在恶变过程中MDR1mRNA表达有所增加。

表1　肺癌及正常肺组织MDR1mRNA表达

　　2.4　不同病理特征患者MDR1mRNA表达　　表2中可以看出，腺癌阳性率较高，达56.5％，但从统计结果来看各病理类型之间无明显差异；小细胞肺癌2例均为阴性；1例肺软组织肉瘤阳性。不同TNM分期及不同分化之间MDR1基因表达无明显区别。

表2　不同病理特征患者的MDR1mRNA表达

　　 *包括SCLC2例，大细胞肺癌1例，肺软组织肉瘤1例

　　2.5　肺癌及癌周肺组织GST－πmRNA表达

　　从表3中可以看出，肺癌组织GST－πmRNA表达明显高于癌周正常肺组织，也提示肺组织细胞癌变后表达GST－πmRNA增加。

表3肺癌及正常肺组织GST－πmRNA表达

　　2.6　不同病理特征患者的GST－πmRNA表达　　从表4中可以看出，不同病理类型、分化程度以及TNM分期之间GST－πmRNA水平之间无明显差异，但腺癌相对来说表达率要高一些。

表4　不同病理特征患者的GST－πmRNA表达

　　 *包括SCLC2例，大细胞肺癌1例，肺软组织肉瘤1例

　　2.7　MDR1和GST－πmRNA表达之间的相关性分析

　　肺癌组织中MDR1和GST－πmRNA存在明显的共同表达，共同表达率达37.3％(19/51)；同时，二者一致性高达80.4％(41/51)，说明二者之间无明显差异。

　　3　讨论

　　3.1　GST－π基因表达在肺癌中的意义

　　许多研究表明某些GST同工酶的表达，特别是π类，与肿瘤的发生有关^[1,2]。我们采用RT－PCR方法对51例肺癌及相应的癌周正常肺组织进行GST－πmRNA水平检测，结果表明，51.0％的肺癌组织（26/51）表达GST－πmRNA，而正常肺组织仅有19.6％(10/51)，二者差别具有统计学意义，提示GST－π基因在肺组织癌变过程中表达明显增加。分析其原因可能与GST－π基因表达的调控有关^[4,5]，在GST－π基因上游存在一个增强子GPE1(Glutathione transferase

　　enhancer1)，它由两个长度为8bp，并与TRE(TPA responseelement)类似的序列构成，在癌变过程中，GPE1受ras基因编码的p21ras蛋白的作用，显著地增加GST－π的表达。因此，在肺癌的发生过程中随着ras基因的激活，GST－π基因表达显著增强。本研究结果还表明GST－π基因表达和肿瘤病理类型、分化程度、TNM分期等均无明显的相关性，但腺癌中GST－π基因表达率高达65.2％，比其它类型都高，这一点与ras基因突变在肺腺癌中最常见是一致的^[6]。由于许多抗癌药物都是GST催化的底物，所以GST－π水平增加意味着肿瘤耐药性的增加。本研究51例肺癌手术标本均未经任何抗癌药物治疗，但GST－π表达却高达51.0％，说明肺癌具有先天或原发耐药性。

　　3.2　MDR1基因表达在肺癌中的意义

　　MDR1基因是最公认的多药耐药机制，但它在肺癌中的表达尚不明确，我们的结果表明，肺癌组织中MDR1基因表达为43.1％(22/51)，而正常肺组织中仅为13.7％(7/51)，提示MDR1基因在肺组织恶变过程中表达增加，它在肺癌先天性耐药中占有重要的地位。我们的结果还表明MDR1基因表达和病理类型、分化程度、TNM分期等病理特征无明显的相关性；这一点与Abe等^[7]报告的一致。但肺腺癌MDR1基因表达率达56.5％(13/23)，比其它类型都高，与临床上肺腺癌对化疗最不敏感是一致的。2例小细胞肺癌均未表达MDR1基因，这和临床初治小细胞肺癌对化疗敏感也是一致的。总之，我们的结果说明MDR1基因在肺癌耐药中具有重要的作用，是多药耐药机制之一。

　　3.3　MDR1和GST－π基因表达之间的关系

　　MDR1和GST－π基因共同表达已在许多肿瘤中得到明确证实^[8]，如难治的白血病和淋巴瘤、多发性骨髓瘤、儿童急性淋巴细胞白血病等。本研究结果表明51例肺癌组织中有19例表现MDR1和GST－π基因共同表达，共同表达率达37.3％；有22例二者均为阴性，二者一致性高达80.4％(41/51)。上述结果说明MDR1和GST－π基因在肺癌中存在明显的共同表达。Volm等分析抗药标志和原癌基因的关系时发现c－fos，EGF－R，K－ras，c－neu等癌基因产物与MDR1，GST－π和TopoⅡ有明显的相关性^[9]。1993年Teeter等报道c－fos和c－jun可能共同参与了MDR1和GST－π基因的调节^[10]。这些可以解释两个基因共表达。此外本研究结果也可以说明在肺癌先天性耐药机制中二者是共存的，而且其重要性相似。联合检测二者可能对临床上前瞻性判断化疗效果以及合理选择化疗药物具有重要的指导作用。

　　作者单位：戴广海　石廷章　李春海　解放军总医院肿瘤内科（北京市100853）

　　李春海　军事学科院基础所

　　参考文献

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　　2 Saburi Y,Nakagawa M,Ono M,et al.Increased expression of glutathione S－ transferase gene in cis－ diammine dichloroplatinum (Ⅱ )resistant variants of a Chinese hamster ovary cell line.Cancer,1993;71(3):667

　　3 金冬雁,黎孟枫,译.分子克隆实验指南.第二版,北京：科技出版社,1995:343

　　4 Hayes JD,Pulford DJ.The glutathione S－ transferase supergene family.Crit Rev biochem Mol Biol,1995;30(6):445

　　5 Tsuchida S,Sato K.Glutathione transferases and cancer.Crit Rev Biochem Mol biol,1992;27(4,5):337

　　6 Slebos RJC,Sc M,Kibbelaar RE,et al.K－ ras oncogene activation as a prognostic marker in adenocarcinoma of the lung.N Engl J Med,1990;323:561

　　7 Abe Y,Nakamura M,Ota E,et al.Expression of the multidrug resistance gene(MDR1) in non－ small cell lung cancer.Jpn J Cancer Res,1994;85:536

　　8 Petrini M,Simone DD,Favati A,et al.GST－ π and P－ 170 co－ expression in multiple myeloma.Br J Haematol,1995;90:393

　　9 Volm M,Kastel M,Mattern J,et al.Expression of resistance factors and their interrelationship to proto－ oncogene products in renal cell carcinomas.Cancer,1993;71(12):3981

　　10 Teeter LD,Eckersberg T,Tsai Y,et al.Analysis of the CHO P－ glycoprotein gene reveals that the AP－ 1 site is essential for full promoter activity.Cell growth Different,1991;2:429