17号染色体微卫星不稳定性和杂合性丢失与非小细胞肺癌的关系

中华结核和呼吸感染 1999年第12期第22卷 论著

作者：郭雪君　倪培华　李莉　邓伟吾

单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院肺科(郭雪君、邓伟吾);上海第二医科大学检验系(倪培华、李莉)

　　关键词： 微卫星不稳定性；杂合性丢失；癌，非小细胞肺

　　【摘要】　目的　明确17号染色体微卫星不稳定性(MI)和杂合性丢失(LOH)与非小细胞肺癌(NSCLC)的关系。方法　对35例NSCLC肿瘤切除组织和肿瘤旁正常组织,采用聚合酶链反应-微卫星长度多态性分析方法检测了17号染色体上4个微卫星位点TP⁵³(17p^13.1)、THRA1(17q^11.2-12)、D17S579(17q^12-21)、D17S855(17q²¹)的MI和LOH。结果　35例NSCLC中,17号染色体MI和（或）LOH的发生率为63%(24/35),其中MI为40%(14/35),LOH为31%(11/35)。同时表现有MI和LOH为9%(3/35)。早期NSCLC(Ⅰ期和Ⅱ期)17号染色体MI和（或）LOH发生率为79%(15/19),明显大于晚期(Ⅲ期)NSCLC(44%,7/16，P＜0.05)。无纵隔淋巴结转移的NSCLC的MI和（或）LOH发生率(87%)亦明显大于已有纵隔淋巴结转移者(48%)，P＜0.05。MI和（或）LOH在不同肿瘤组织类型以及不同组织细胞分化程度之间差异无显著性，P＞0.05。结论　17号染色体MI和LOH在NSCLC的发生中可能起一定的作用,而且是NSCLC发生中的早期基因改变。

Studies of microsatellite instability and loss of heterozygosity at chromosome 17 in non-small cell lung carcinoma

GUO Xuejun, nI Peihua, LI Li,et al.

　　Department of Respiratory Medicine, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, shanghai 200025

　　【Abstract】　Objective　To identify the presence of microsatellite instability (MI) and loss of heterozygosity (LOH) in non-small cell lung carcinoma (NSCLC). Methods　Four microsatellite markers TP⁵³(17p^13.1),THRA1(17q^11.2-12),D17S579(17q^12-21) and D17S855(17q²¹) were used to examine 35 cases of NSCLC tumor-normal paired tissues for MI and LOH at chromosome 17 using PCR based analysis. Results　22 of 35 tumors(63%) displayed MI or LOH. 14 tumors(40%)exhibited MI, 11 tumors(31%) exhibited LOH, while 3 tumors (9%) exhibited MI and LOH concurrently. The frequency of MI or LOH was obviously higher in the early-stage(stagesⅠandⅡ,79%) than in the advanced-stage (stage Ⅲ,44%)，P＜0.05. however, the frequency of MI or LOH had no significant difference between high-grade differentiated NSCLC tumors and low-grade ones, P＞0.05. No relationship was observed between the presence of MI or LOH and the histologic subtype of NSCLC, P＞0.05. Conclusions　The results suggest that MI and LOH at chromosome 17 may play a significant role in the development of NSCLC. The high frequency of MI or LOH in the early-stage tumors indicates that these genetic alterations could occur early during NSCLC development.

　　【Key words】　Microsatellite instability　　Loss of heterozygosity　　Carcinoma, non-small cell lung

　　尽管肺癌的发生率和死亡率仍逐年升高,但其发生的确切分子机制仍不清楚。肺癌中癌基因和抑癌基因的改变已得到广泛的研究^［1］。近年,人们越来越对肺癌中遗传物质的微卫星不稳定性(MI)和杂合性丢失(LOH)的研究感兴趣。特别是近年的研究表明MI亦参与了肿瘤的发生与发展,可能是肿瘤发生的一种新机制。微卫星(microsatellite)是广泛存在且随机分布于基因组中的高度多态性简单重复序列,又称短的串联重复序列(short tandem repeat)。微卫星不稳定性是指分布于基因组中短小串联重复序列的突变,反映了由于错配修复基因(mismatch repair gene)异常导致的DNA复制错误(RER)^［2］。

　　有关NSCLC中17号染色体遗传改变(如MI,LOH)的研究相对较少,国外有关的研究存在相互矛盾的结果。我们的目的是发现NSCLC肿瘤组织中17号染色体存在MI和LOH的证据,以及它们与NSCLC生物学特征之间的关系。

　　材料与方法

　　一、材料

　　35例NSCLC的手术切除肿瘤组织及肿瘤旁距病灶2 cm无癌细胞浸润的正常肺组织各1块（1 cm×1 cm×1 cm）,-80℃冻存。NSCLC按Mountain肺癌分期标准^［3］，分为早期NSCLC(Ⅰ期和Ⅱ期)和晚期NSCLC(Ⅲ期)。

　　二、方法

　　1.DNA抽提:将冻存组织切成碎块,加入少量液氮于研钵中碾磨至粉末状,加入裂解液至终体积5 ml，37℃孵育过夜，酚/氯仿抽提,无水乙醇沉淀,TE溶解。

　　2.聚合酶链反应（PCR）扩增: 用于PCR扩增的4个位于17号染色体上的微卫星位点分别为TP⁵³(17p^13.1)、THRA1(17q^11.2-12)、D17S579(17q^12-21)和D17S855(17q²¹)。微卫星DNA引物根据文献［4,5］由中国科学院上海细胞所合成。PCR反应体系为50μl,含10×扩增缓冲液,2.5 mmol/L dNTP,200 ng基因组DNA, 1U Taq酶(Promega公司)。反应条件为:95℃预变性5分钟,随后95℃1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2 分钟,共35个循环，72℃延伸7分钟。PCR产物4℃保存。

　　3.MI和LOH检测：10 μl PCR产物95℃变性5分钟,冰上骤冷后,上样于8%非变性聚丙烯酰胺,40 w电泳2～3小时,取下凝胶银染,行凝胶图像扫描。MI的判断标准:同自身正常肺组织比较,肿瘤组织微卫星标记扩增产物的电泳出现一个或多个等位基因条带的增加或缺失,即为MI。LOH的判断标准:同自身正常肺组织比较,肿瘤组织微卫星标记扩增产物电泳的等位基因条带密度降低≥50%,即为LOH^［6］。

　　4.统计学处理：组间比较采用χ²检验。

　　结果

　　一、NSCLC的MI和LOH

　　35例NSCLC中22例(63%)表现有MI和(或)LOH；14例(40%)表现为MI；11例(31%)表现为LOH。TP⁵³、THRA、D17S579和D17S855四个微卫星位点发生MI和（或）LOH的频率分别为40％、9％、17％和6％。19例(54%)表现为单个微卫星位点的基因改变,3例(9%)表现为2个微卫星位点同时有基因改变(表1)。在4个17号染色体上的微卫星位点中,MI频率最高的是TP⁵³(23%,8/35),而LOH发生率最高的亦为TP⁵³(20%,7/35)。17号染色体短臂(17p)上微卫星位点发生基因改变的频率为40%(14/35),而长臂(17q)则为26%(9/35)。

表1　NSCLC17号染色体的MI和LOH

　　注：MI指微卫星不稳定性；LOH指杂合性丢失；H指杂合性存在；N指未获得实验信息　　二、MI和（或）LOH与NSCLC生物学特征关系

　　19例早期肺癌(Ⅰ期和Ⅱ期)中有15例表现为MI和（或）LOH(79%),而在16例晚期肺癌(Ⅲ期)中有7例表现为MI和（或）LOH(44%,P＜0.05)。无纵隔淋巴结转移的NSCLC的MI和（或）LOH发生率(87%)明显大于有纵隔淋巴结转移者(48%,P＜0.05)。然而,MI和（或）LOH在NSCLC不同组织类型之间以及肿瘤组织不同分化程度之间差异无显著性(表2)。

表2　17号染色体MI和LOH与NSCLC生物学特征的关系

　　讨论

　　我们的结果表明,NSCLC中17号染色体上有高频率的MI和（或）LOH,提示NSCLC存在基因组不稳定性。有关肺癌中微卫星不稳定性的研究,尚存在矛盾性的结论。Fong等^［7］发现在NSCLC中MI罕见(6.5%)且仅限于一个微卫星标记。然而,我们的研究结果同Froudarakis等^［6］的报道一致。Froudarakis等发现20例NSCLC中有16例纤支镜活检肿瘤组织表现有17和9号染色体上的MI和（或）LOH(80%)。其中,MI为30%,LOH为25%。对这种在不同研究中微卫星不稳定性频率不同,Sheridhar等^［8］提出一种解释,即选用不同染色体上微卫星标记位点和数目的不同,其不稳定性的频率可能不同。

　　微卫星不稳定性散布于整个基因组,称为广泛的体细胞突变。研究表明,微卫星不稳定性是由于错配修复基因的突变引起。正常情况下,错配修复基因通过特异性对由于DNA聚合酶所造成的错误掺入进行修复而保持DNA修复的真实性。错配修复基因的缺陷导致复制后错配修复功能丧失,进而增加细胞自发突变的频率而使细胞出现所谓的突变子表型。突变子表型被认为是能够导致多步癌变过程所需的多重突变。最为常见的突变子表型为微卫星的复制错误,即出现所谓的RER,而后者成为微卫星不稳定性的基础。微卫星不稳定所形成的错配核苷酸经过一轮DNA复制和细胞分裂后被保留在基因组中,微卫星不稳定性导致基因组中其它基因不稳定,即出现基因组不稳定性^［9］。染色体上等位基因LOH高频率出现,通常提示相应位点存在抑癌基因。我们在研究中发现17号染色体MI和（或）LOH在早期NSCLC(Ⅰ期和Ⅱ期)的发生率明显大于晚期NSCLC(Ⅲ期),而且,MI和（或）LOH在无纵隔淋巴结转移NSCLC中明显多于有纵隔淋巴结转移者,提示微卫星基因改变主要发生于肺癌的早期阶段,这与Sheridhar等^［8］的结果相一致。Miozzo等^［10］和Rosell等^［11］的研究均发现DNA复制错误型不稳定型(replication error type instability， RER⁺。即微卫星MI或LOH)主要见于Ⅰ期肺癌。Suzuki等^［12］的研究则显示微卫星不稳定性与肺癌的分期无关。目前，尚无法对这些不同结果作出明确的解释。我们的研究还显示TP⁵³(17p^13.1)位点的LOH频率最高(40%)，这与该位点存在抑癌基因P⁵³相一致。本课题受卫生部科研基金资助(基金编号:94-1-316)

　　参考文献

　　1　郭雪君,倪培华,邓伟吾，等. 非小细胞肺癌P53基因突变的研究.上海第二医科大学学报，1998,18:451-454.

　　2　Loeb LA. Microsatellite instability:marker of a mutator phenotype in cancer. Cancer Res,1994，54:5059-5063.

　　3　Mountain CF. A new international staging system for lung cancer. chest,1986,89 Suppl:225s-233s.

　　4　Futreal PA, Soderkvist JR, Marks JD,et al. Detection of frequent allelic loss on proximal chromosome 17q in sporadic breast carcinoma using microsatellite length polymorphisms. Cancer Res,1992,52,2624-2627.

　　5　Gao X,Zacharek A, Salkowsk A, et al. Loss of heterozygosity of the BRCA1 and other loci on chromosome 17q in human prostate cancer. Cancer res,1995,55:1002-1005.

　　6　Froudarakis ME, Bouros D, Spandidos DA, et al. Microsatellite instability and loss of heterozygosity at chromosome 17 in non-small cell lung cancer. chest,1998,113:1091-1095.

　　7　Fong KM, Zimmerman PV, Smith PJ,et al. Microsatellite instability and other molecular abnormalities in non-small cell lung cancer. Cancer res,1994,54:2098-2101.

　　8　Sheridhar V, Siegfried J, Hunt J, et al. Genetic instability of microsatellite sequences in many non-small cell lung carcinomas. Cancer res,1994,54:2084-2087.

　　9　邓锡云,曹亚.基因组不稳定性与肿瘤.国外医学遗传学分册,1997,20:16-21.

　　10　 Miozzo M, Sozzi G, Musso T, et al. Microsatellite alterations in bronchial and sputum of lung cancer patients. Cancer Res, 1996,56: 2285-2288.

　　11　 Rosell R, Pifarre A, Monzo M, et al. Reduced survival in patients with stage-I non-small-cell lung cancer associated with DNA-replication errors. Int J cancer, 1997,74:330-334.

　　12　 Suzuki K, Ogura T, Yokose T, et al. Microsatellite instability in female non-small- cell lung cancer patients with familial clustering of malignancy. Br j Cancer, 1998,77:1003-1008.

收稿：1999-03-02　　修回：1999-06-08